曲古抑菌素A预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响

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曲古抑菌素A预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响
王雅枫夏中元*袁泉刘恋赵博
武汉大学人民医院麻醉科湖北武汉430060
[摘要] 目的探讨曲古抑菌素A (TSA)预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响。

方法Balb/c小鼠随机分为3组(n=10),假手术组(S组),缺血再灌注组(IR组),TSA预处理组(TSA组)。

采用MCAO法缺血1h,再灌注24h 建立脑缺血再灌注模型,TSA组在建立脑缺血再灌注前连续3d腹腔注射TSA 5mg/kg。

取脑组织,光镜下观察病理学结果,ELISA法检测TNF-α,IL-1β,免疫组化检测Bcl-2,Bax,Caspase-3,TUNEL法检测细胞凋亡。

结果与S组相比,IR组病理学损伤严重,TNF-α,IL-1β,Bax,Caspase-3,TUNEL增高,Bcl-2降低(P<0.05);与IR组相比,TSA组病理学损伤减轻,TNF-α,IL-1β,Bax,Caspase-3,TUNEL降低,Bcl-2升高(P<0.05)。

结论曲古抑菌素A预处理通过抑制炎症因子和凋亡因子的表达,减少细胞凋亡,从而减轻脑缺血再灌注损伤。

[关键词] 曲古抑菌素A,炎症因子,凋亡因子,脑缺血再灌注损伤
The Preconditioning Effect of Trichostatin A in Cerebral Ischemia Reperfusion Injury on Inflammatory factors and Apoptosis factor
Wang Yafeng, Xia Zhongyuan,Yuan Quan, Liu Lian, Zhao Bo
Department of Anesthesiology, Renmin Hospital of Wuhan University, 430060, China [Abstract]Objective to evaluate the preconditioning effect of Trichostatin A in cerebral ischemia reperfusion injury on inflammatory factors and apoptosis factor. Methods Three groups mice(n=10), sham group (S); ischemia reperfusion group (IR); ischemia reperfusion and pretreated with TSA group (TSA). The model of ischemia reperfusion group was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO). TSA, 5mg/kg, was intraperitoneally given for 3 days before MCAO. The histopathology was detected by HE staining, TNF-α, IL-1βwere examed by ELISA; Bcl-2, Bax, Caspase-3 were detected by immunohistochemical, the apoptosis was detected by TUNEL. Results When compared with S group, histopathology, TNF-α, IL-1β, Bax, Caspase-3, TUNEL were increased, Bcl-2 were decreased in IR group (P<0.05); compared with IR group, histopathology, TNF-α, IL-1β, TUNEL were decreased, Bcl-2 were increased in TSA group (P<0.05). Conclusion TSA has a protective effect in cerebral ischemia reperfusion by decreasing the expression of inflammatory factors and apoptosis factor, reducing the apoptosis.
[Key words] Trichostatin A, inflammatory factors, apoptosis factor, cerebral ischemia reperfusion injury
脑缺血再灌注损伤是指经治疗后缺血脑组织再度获得血液供应,然而损伤程度并没有好转反而进一步加重的现象,称之为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemic reperfusion injury,CIRI)[1,2]。

其具有高发病率、高致残率及高致死率的特点,是严重威胁人类健康的疾病之一[3]。

脑缺血再灌注后,机体组织的自我修复是研究的热点之一。

胶质细胞在中枢神经系统中发挥着支持神经元、分泌神经营养因子及免疫应答等重要功能[4,5]。

*通信作者: 夏中元, Email:
基金项目: 国家自然科学基金(),湖北省自然科学基金(2017CFB267)
因此在中枢神经系统受损时,其发生活化进而调控炎症因子和凋亡因子的表达,使受损神经元得到修复。

新近研究表明,脑缺血再灌注损伤中基因表达出现异常,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi)可以产生脑保护作用[6]。

HDACi 是通过何种机制脑缺血再灌注损伤产生保护作用?本研究旨在探讨HDACi预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子表达的影响。

材料与方法
动物选择及分组:清洁级健康成年雄性Balb/c小鼠,体重18~22g,购自武汉市生物制品研究所。

采用随机数字表法分为3组(n=10):假手术组(S组),缺血再灌注组(IR组),曲古抑菌素A预处理组(TSA组)。

采用MCAO法缺血1h,再灌注24h建立脑缺血再灌注模型,TSA组在建立脑缺血再灌注前连续3d腹腔注射TSA5mg/kg。

脑缺血再灌注损伤模型制备:异氟烷深度麻醉动物,暴露左侧颈外动脉(External carotid artery, ECA),于ECA内插入6-0单丝线栓直达大脑中动脉分支处,线栓于大脑中动脉中留置45min后小心取出。

模型成功的标志是动物麻醉苏醒后出现缺血对侧以前肢为重的偏瘫。

指标测定:再灌注24h后处死小鼠取脑组织。

(1)制备石蜡切片,置于4%多聚甲醛溶液中固定24h,HE染色,光镜(×400)下观察病理学结果。

(2) ELISA法检测TNF-α,IL-1β:脑皮质组织匀浆,离心后提取上清液。

严格按试剂盒说明书(武汉博士德,中国)操作。

所得样本用酶标仪在测定吸光值并计算对应样品浓度。

(3) 免疫组化法检测Bax,Bcl-2,Caspase-3 (中杉金桥,中国):切片入水,3%H2O2孵育10 min,滴加多克隆抗体,4℃孵育过夜;滴加二抗,37℃孵育20 min,滴加SP,37℃孵育20 min,DAB显色。

(4) TUNEL法测定细胞凋亡(Roche,美国):切片入水,3%H2O2孵育10 min,滴加蛋白酶K,37℃消化10 min,加入反应混合液,37℃孵育60 min,加入转化剂,37℃孵育30 min,DAB显色。

统计学处理:采用SPSS17软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组问比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结果
光镜下:S组与TSA组神经元排列相对整齐,胞膜完整,胞质丰富,核圆形,结构较为清晰;IR组神经元形态不规则,胞质分布不均,有空泡,核固缩溶解或消失。

见图1。

图1:三组小鼠脑组织HE染色图片
S组IR组TSA组
与S组相比,IR组TNF-α,IL-1β,TUNEL增高(P<0.05);与IR组相比,IR+T组TNF-α,IL-1β,TUNEL降低(P<0.05);与IR+T组相比,IR+T/L组TNF-α,IL-1β,TUNEL升高(P<0.05)。

见表1,图2。

表1:三组小鼠TNF-α,IL-1β,TUNEL的比较(n=5,x±s)
TNF-α (pg/mg) IL-1β (pg/mg) TUNEL(%)
S组 5.7±0.813.6±1.3 6.3±0.6
IR组12.8±1.5 a28.3±3.6 a21.4±2.8 a
TSA组9.3±1.4 ab22.7±2.2 ab15.8±1.5 ab
注:与S组比较,a P<0.05;与IR组比较,b P<0.05
图2:三组小鼠脑组织TUNEL染色图片
S组IR组TSA组与S组相比,IR组Bax,Caspase-3增高,Bcl-2降低(P<0.05);与IR组相比,TSA组Bax,Caspase-3降低,Bcl-2升高(P<0.05)。

见表2,图3-5。

表2:四组Bax,Bcl-2,Caspase-3的比较(n=5,x±s)
Bax Bcl-2 Caspase-3
S组 6.3±1.123.7±2.7 5.4±0.7
IR组19.4±2.2 a7.3±1.1 a17.6±2.5 a
TSA组14.9±1.4 ab11.5±2.3 ab13.2±1.1 ab
注:与S组比较,a P<0.05;与IR组比较,b P<0.05
图3:三组小鼠脑组织Bax染色图片
S组IR组TSA组
图4:三组小鼠脑组织Bcl-2染色图片
S组IR组TSA组
图5:三组小鼠脑组织Caspase-3染色图片
S组IR组TSA组
讨论
脑缺血性再灌注损伤有众多假说,包括炎症反应,氧化应激,细胞凋亡,钙超载,免疫调控,兴奋性氨基酸毒性,血脑屏障破坏以及神经血管单元的相互作用等。

在这些假说中,炎症反应与氧化应激最为经典[7,8]。

脑缺血再灌注损伤早中期主要表现为自由基的产生、线粒体功能障碍、炎性反应、神经元凋亡等,后期则以神经再生、血管新生、胶质细胞增殖及小胶质细胞活化等表现为主[7]。

新近研究表明,脑缺血再灌注损伤基因表达异常,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi)可通过调节组蛋白和非组蛋白的修饰,作用于缺血性脑卒中损伤机制中的多个环节,减轻脑组织损伤并积极促进缺血区血运重建,促进缺血后神经元可塑性和功能恢复[6,9]。

研究表明,HDAC抑制剂(HDAc inhibitor,HDACi)可以纠正中枢神经病理条件下的染色体从“封闭”转变成“开放”状态,起到神经保护的作用。

其包括:抑制神经元凋亡,调控小胶质细胞/巨噬细胞的极化、减轻炎性反应、促进神经血管再生等[10]。

小胶质细胞作为神经胶质细胞的一种,其对脑内微环境的改变十分敏感,在大脑中起到免疫监视和防御的作用。

正常状态下,小胶质细胞处于静息状态,当在外源性或内源性刺激的作用下,其迅速活化,产生并释放促炎因子如:TNF-α,IL-1β,并通过交互作用诱导凋亡因子的释放。

小胶质细胞对大脑正常功能的维持至关重要,有助于消灭病原体,清除凋亡和坏死的神经元,是脑防御的重要机制[11,12]。

我们的研究结果证实:小胶质细胞释放的TNF-α,IL-1β参与了脑缺血再灌注损伤的进展,并诱导产生凋亡因子Bax,Caspase-3,当应用TSA后,炎症因子TNF-α,IL-1β表达降低,凋亡因子Bax,Caspase-3降低,Bcl-2升高。

综上所述,曲古抑菌素A预处理通过抑制炎症因子和凋亡因子的表达,减少细胞凋亡,从而减轻脑缺血再灌注损伤。

参考文献
1.Park H, Hong M, Jhon GJ, et al. Repeated Oral Administration of Human Serum
Albumin Protects from the Cerebral Ischemia in Rat Brain Following MCAO.
Exp Neurobiol. 2017, 26(3):151-157.
2.Shamsaei N, Erfani S, Fereidoni M, et al. Neuroprotective Effects of Exercise on
Brain Edema and Neurological Movement Disorders Following the Cerebral Ischemia and Reperfusion in Rats. Basic Clin Neurosci. 2017,8(1):77-84.
3.Shin DH, Kim GH, Lee JS, et al. Comparison of MSC-Neurogenin1
administration modality in MCAO rat model. Transl Neurosci. 2016,7(1):
164-172.
4.Anderson MA, Burda JE, Ren Y, et al. Astrocyte scar formation aids central
nervous system axon regeneration. Nature, 2016, 532(7598): 195-200
5.Verkhratsky A, Matteoli M, Parpura V, et al. Astrocytes as secretory cells of the
central nervous system: idiosyncrasies of vesicular secretion. EMBO J, 2016, 35(3): 239-257
6.Fessler EB, Chibane FL, Wang Z, et al. Potential roles of HDAC inhibitors in
mitigating ischemia-induced brain damage and facilitating endogenous regeneration and recovery. Curr Pharm Des. 2013,19(28):5105-5120.
7.Wang CP, Shi YW, Tang M, et al. Isoquercetin Ameliorates Cerebral Impairment
in Focal Ischemia Through Anti-Oxidative, Anti-Inflammatory, and Anti-Apoptotic Effects in Primary Culture of Rat Hippocampal Neurons and Hippocampal CA1 Region of Rats. Mol Neurobiol. 2017,54(3):2126-2142
8.Lobo-Silva D, Carriche GM, Castro AG, et al.Balancing the immune response in
the brain: IL-10 and its regulation.J Neuroinflammation. 2016,13(1):297.
9.Dregan A, Charlton J, Wolfe CD, et al.Is sodium valproate, an HDAC inhibitor,
associated with reduced risk of stroke and myocardial infarction? A nested case-control study. Pharmacoepidemiol Drug Saf. 2014,23(7):759-767.
10.Ganai SA, Ramadoss M, Mahadevan V. Histone Deacetylase (HDAC) Inhibitors -
emerging roles in neuronal memory, learning, synaptic plasticity and neural Neuropharmacol. 2016,14(1):55-71.
11.Kim H, Bae S, Kwon KY, et al.A combinational effect of acetaminophen and
oriental herbs on the regulation of inflammatorymediators in microglia cell line, Cell Biol. 2015,48(4):244-250.
12.Fan Y, Xie L, Chung CY. Signaling Pathways Controlling Microglia Cells.
2017,40(3):163-168.。

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