曲古抑菌素A预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响
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曲古抑菌素A预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响
王雅枫夏中元*袁泉刘恋赵博
武汉大学人民医院麻醉科湖北武汉430060
[摘要] 目的探讨曲古抑菌素A (TSA)预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子的影响。
方法Balb/c小鼠随机分为3组(n=10),假手术组(S组),缺血再灌注组(IR组),TSA预处理组(TSA组)。
采用MCAO法缺血1h,再灌注24h 建立脑缺血再灌注模型,TSA组在建立脑缺血再灌注前连续3d腹腔注射TSA 5mg/kg。
取脑组织,光镜下观察病理学结果,ELISA法检测TNF-α,IL-1β,免疫组化检测Bcl-2,Bax,Caspase-3,TUNEL法检测细胞凋亡。
结果与S组相比,IR组病理学损伤严重,TNF-α,IL-1β,Bax,Caspase-3,TUNEL增高,Bcl-2降低(P<0.05);与IR组相比,TSA组病理学损伤减轻,TNF-α,IL-1β,Bax,Caspase-3,TUNEL降低,Bcl-2升高(P<0.05)。
结论曲古抑菌素A预处理通过抑制炎症因子和凋亡因子的表达,减少细胞凋亡,从而减轻脑缺血再灌注损伤。
[关键词] 曲古抑菌素A,炎症因子,凋亡因子,脑缺血再灌注损伤
The Preconditioning Effect of Trichostatin A in Cerebral Ischemia Reperfusion Injury on Inflammatory factors and Apoptosis factor
Wang Yafeng, Xia Zhongyuan,Yuan Quan, Liu Lian, Zhao Bo
Department of Anesthesiology, Renmin Hospital of Wuhan University, 430060, China [Abstract]Objective to evaluate the preconditioning effect of Trichostatin A in cerebral ischemia reperfusion injury on inflammatory factors and apoptosis factor. Methods Three groups mice(n=10), sham group (S); ischemia reperfusion group (IR); ischemia reperfusion and pretreated with TSA group (TSA). The model of ischemia reperfusion group was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO). TSA, 5mg/kg, was intraperitoneally given for 3 days before MCAO. The histopathology was detected by HE staining, TNF-α, IL-1βwere examed by ELISA; Bcl-2, Bax, Caspase-3 were detected by immunohistochemical, the apoptosis was detected by TUNEL. Results When compared with S group, histopathology, TNF-α, IL-1β, Bax, Caspase-3, TUNEL were increased, Bcl-2 were decreased in IR group (P<0.05); compared with IR group, histopathology, TNF-α, IL-1β, TUNEL were decreased, Bcl-2 were increased in TSA group (P<0.05). Conclusion TSA has a protective effect in cerebral ischemia reperfusion by decreasing the expression of inflammatory factors and apoptosis factor, reducing the apoptosis.
[Key words] Trichostatin A, inflammatory factors, apoptosis factor, cerebral ischemia reperfusion injury
脑缺血再灌注损伤是指经治疗后缺血脑组织再度获得血液供应,然而损伤程度并没有好转反而进一步加重的现象,称之为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemic reperfusion injury,CIRI)[1,2]。
其具有高发病率、高致残率及高致死率的特点,是严重威胁人类健康的疾病之一[3]。
脑缺血再灌注后,机体组织的自我修复是研究的热点之一。
胶质细胞在中枢神经系统中发挥着支持神经元、分泌神经营养因子及免疫应答等重要功能[4,5]。
*通信作者: 夏中元, Email:
基金项目: 国家自然科学基金(),湖北省自然科学基金(2017CFB267)
因此在中枢神经系统受损时,其发生活化进而调控炎症因子和凋亡因子的表达,使受损神经元得到修复。
新近研究表明,脑缺血再灌注损伤中基因表达出现异常,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi)可以产生脑保护作用[6]。
HDACi 是通过何种机制脑缺血再灌注损伤产生保护作用?本研究旨在探讨HDACi预处理在脑缺血再灌注损伤中对炎症因子和凋亡因子表达的影响。
材料与方法
动物选择及分组:清洁级健康成年雄性Balb/c小鼠,体重18~22g,购自武汉市生物制品研究所。
采用随机数字表法分为3组(n=10):假手术组(S组),缺血再灌注组(IR组),曲古抑菌素A预处理组(TSA组)。
采用MCAO法缺血1h,再灌注24h建立脑缺血再灌注模型,TSA组在建立脑缺血再灌注前连续3d腹腔注射TSA5mg/kg。
脑缺血再灌注损伤模型制备:异氟烷深度麻醉动物,暴露左侧颈外动脉(External carotid artery, ECA),于ECA内插入6-0单丝线栓直达大脑中动脉分支处,线栓于大脑中动脉中留置45min后小心取出。
模型成功的标志是动物麻醉苏醒后出现缺血对侧以前肢为重的偏瘫。
指标测定:再灌注24h后处死小鼠取脑组织。
(1)制备石蜡切片,置于4%多聚甲醛溶液中固定24h,HE染色,光镜(×400)下观察病理学结果。
(2) ELISA法检测TNF-α,IL-1β:脑皮质组织匀浆,离心后提取上清液。
严格按试剂盒说明书(武汉博士德,中国)操作。
所得样本用酶标仪在测定吸光值并计算对应样品浓度。
(3) 免疫组化法检测Bax,Bcl-2,Caspase-3 (中杉金桥,中国):切片入水,3%H2O2孵育10 min,滴加多克隆抗体,4℃孵育过夜;滴加二抗,37℃孵育20 min,滴加SP,37℃孵育20 min,DAB显色。
(4) TUNEL法测定细胞凋亡(Roche,美国):切片入水,3%H2O2孵育10 min,滴加蛋白酶K,37℃消化10 min,加入反应混合液,37℃孵育60 min,加入转化剂,37℃孵育30 min,DAB显色。
统计学处理:采用SPSS17软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组问比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
结果
光镜下:S组与TSA组神经元排列相对整齐,胞膜完整,胞质丰富,核圆形,结构较为清晰;IR组神经元形态不规则,胞质分布不均,有空泡,核固缩溶解或消失。
见图1。
图1:三组小鼠脑组织HE染色图片
S组IR组TSA组
与S组相比,IR组TNF-α,IL-1β,TUNEL增高(P<0.05);与IR组相比,IR+T组TNF-α,IL-1β,TUNEL降低(P<0.05);与IR+T组相比,IR+T/L组TNF-α,IL-1β,TUNEL升高(P<0.05)。
见表1,图2。
表1:三组小鼠TNF-α,IL-1β,TUNEL的比较(n=5,x±s)
TNF-α (pg/mg) IL-1β (pg/mg) TUNEL(%)
S组 5.7±0.813.6±1.3 6.3±0.6
IR组12.8±1.5 a28.3±3.6 a21.4±2.8 a
TSA组9.3±1.4 ab22.7±2.2 ab15.8±1.5 ab
注:与S组比较,a P<0.05;与IR组比较,b P<0.05
图2:三组小鼠脑组织TUNEL染色图片
S组IR组TSA组与S组相比,IR组Bax,Caspase-3增高,Bcl-2降低(P<0.05);与IR组相比,TSA组Bax,Caspase-3降低,Bcl-2升高(P<0.05)。
见表2,图3-5。
表2:四组Bax,Bcl-2,Caspase-3的比较(n=5,x±s)
Bax Bcl-2 Caspase-3
S组 6.3±1.123.7±2.7 5.4±0.7
IR组19.4±2.2 a7.3±1.1 a17.6±2.5 a
TSA组14.9±1.4 ab11.5±2.3 ab13.2±1.1 ab
注:与S组比较,a P<0.05;与IR组比较,b P<0.05
图3:三组小鼠脑组织Bax染色图片
S组IR组TSA组
图4:三组小鼠脑组织Bcl-2染色图片
S组IR组TSA组
图5:三组小鼠脑组织Caspase-3染色图片
S组IR组TSA组
讨论
脑缺血性再灌注损伤有众多假说,包括炎症反应,氧化应激,细胞凋亡,钙超载,免疫调控,兴奋性氨基酸毒性,血脑屏障破坏以及神经血管单元的相互作用等。
在这些假说中,炎症反应与氧化应激最为经典[7,8]。
脑缺血再灌注损伤早中期主要表现为自由基的产生、线粒体功能障碍、炎性反应、神经元凋亡等,后期则以神经再生、血管新生、胶质细胞增殖及小胶质细胞活化等表现为主[7]。
新近研究表明,脑缺血再灌注损伤基因表达异常,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi)可通过调节组蛋白和非组蛋白的修饰,作用于缺血性脑卒中损伤机制中的多个环节,减轻脑组织损伤并积极促进缺血区血运重建,促进缺血后神经元可塑性和功能恢复[6,9]。
研究表明,HDAC抑制剂(HDAc inhibitor,HDACi)可以纠正中枢神经病理条件下的染色体从“封闭”转变成“开放”状态,起到神经保护的作用。
其包括:抑制神经元凋亡,调控小胶质细胞/巨噬细胞的极化、减轻炎性反应、促进神经血管再生等[10]。
小胶质细胞作为神经胶质细胞的一种,其对脑内微环境的改变十分敏感,在大脑中起到免疫监视和防御的作用。
正常状态下,小胶质细胞处于静息状态,当在外源性或内源性刺激的作用下,其迅速活化,产生并释放促炎因子如:TNF-α,IL-1β,并通过交互作用诱导凋亡因子的释放。
小胶质细胞对大脑正常功能的维持至关重要,有助于消灭病原体,清除凋亡和坏死的神经元,是脑防御的重要机制[11,12]。
我们的研究结果证实:小胶质细胞释放的TNF-α,IL-1β参与了脑缺血再灌注损伤的进展,并诱导产生凋亡因子Bax,Caspase-3,当应用TSA后,炎症因子TNF-α,IL-1β表达降低,凋亡因子Bax,Caspase-3降低,Bcl-2升高。
综上所述,曲古抑菌素A预处理通过抑制炎症因子和凋亡因子的表达,减少细胞凋亡,从而减轻脑缺血再灌注损伤。
参考文献
1.Park H, Hong M, Jhon GJ, et al. Repeated Oral Administration of Human Serum
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3.Shin DH, Kim GH, Lee JS, et al. Comparison of MSC-Neurogenin1
administration modality in MCAO rat model. Transl Neurosci. 2016,7(1):
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5.Verkhratsky A, Matteoli M, Parpura V, et al. Astrocytes as secretory cells of the
central nervous system: idiosyncrasies of vesicular secretion. EMBO J, 2016, 35(3): 239-257
6.Fessler EB, Chibane FL, Wang Z, et al. Potential roles of HDAC inhibitors in
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7.Wang CP, Shi YW, Tang M, et al. Isoquercetin Ameliorates Cerebral Impairment
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10.Ganai SA, Ramadoss M, Mahadevan V. Histone Deacetylase (HDAC) Inhibitors -
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12.Fan Y, Xie L, Chung CY. Signaling Pathways Controlling Microglia Cells.
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