抗流感药物靶点及其抑制剂

抗流感药物靶点及其抑制剂

流感病毒是一种负螺旋单链RNA病毒，属于正黏病毒科。根据病毒核蛋白（nucleoproteins，NP）及基质蛋白（matrix proteins，M1）的抗原决定簇不同，流感病毒被分为三类：甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）。流感病毒颗粒结构大致相似（如图1），自内而外可分成核心、基质蛋白以及包膜三部分。病毒子通常呈圆形，长丝状。甲型和乙型流感病毒核酸有八个RNA节段，负责编码十种蛋白，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、酸性蛋白（PA）、碱性蛋白1（PB1）、PB2、核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、离子通道蛋白（M2）、非结构蛋白（NS1）、核输出蛋白（NEP或NS2）。此外，大多数甲型流感病毒还有线粒体靶向的寡聚PB1-F2蛋白[1]，报道其与细胞凋亡以及病毒毒力有关。这些病毒RNA片段同NP 结合并缠绕形成病毒核糖核蛋白体（vRNP），vRNP再与三聚的RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）结合形成核糖核苷酸，负责RNA的复制和转录，这种结合模式确保了病毒RNA对于核酸酶保持敏感。丙型流感病毒只有七个RNA节段。基因组分节段的特点为流感病毒高频率基因重配提供了条件。病毒核心被外部的脂蛋白膜包围，在脂膜上有基质蛋白M1，其是病毒颗粒的主要蛋白，并通过化学键结合到vRNP。M2蛋白为具有离子通道活性的跨膜蛋白。乙型流感病毒缺乏M2蛋白，但是一种叫做BM2的蛋白可以起到类似M2蛋白作用。病毒最外层的包膜是包裹基质蛋白的磷脂双分子层，该膜来源于宿主细胞的细胞膜。膜表面具有两类非常重要的“刺突”，即两种糖蛋白，HA和NA。乙型流感病毒表面抗原相对简单，仅有一种HA 和一种NA。对于甲型流感，根据病毒表面抗原HA及NA的不同，其可进一步细分为16个HA亚型（H1 ～ H16）、9个NA亚型(N1 ～ N9)[2]。

图1 甲型流感病毒结构模式图[3]

三种类型流感病毒的宿主范围也是有区别的：甲型流感病毒能够感染哺乳类动物（人、猪、马等）和禽类，乙型流感病毒主要在人类和猪间传播，丙型流感病毒只在人类传播。另外，三种病毒的变异性及危害性从大到小依次是甲型、乙型、丙型，因此，对人类危害性最大的是甲型流感病毒。

流感病毒感染及增殖过程

图2 流感病毒感染及增殖机制[4]

如图2所示，流感病毒感染及增殖过程可大致分为黏附→内吞→融合→去包膜→入核→vRNA合成→蛋白合成→出核→组装→出芽→释放等阶段。

首先，流感病毒包膜表面抗原HA识别并粘附到宿主细胞膜表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸（sialic acid，SA）受体上，在粘附阶段，神经氨酸酶的唾液酸酶活性阻止HA与气管上皮细胞粘液层唾液酸的结合，从而强化病毒感染。接着，在受体介导的细胞内吞作用下，结合于宿主细胞表面的病毒进入宿主细胞并形成胞内体（endosome）。胞内体内的低pH条件启动HA“融合域”构象转化，导致病毒包膜与胞内体膜发生融合。与此同时，非糖基化基质蛋白M2离子通道被激活，形成进入细胞内膜的内向质子流，引发基质蛋白M1与vRNP的解离。然后，vRNP被转运进入细胞核，启动病毒遗传信息的复制和转录。RdRP以及NP对流感病毒的转录和复制具有重要意义。新合成的NP以及RNA聚合酶也被转入细胞核，与新和成的vRNA结合形成子代vRNP。在非结构性的核输出蛋白NEP/NS2及基质蛋白M1介导下，核内形成的子代vRNP被转运出宿主细胞核进入细胞浆，经装配形成成熟病毒颗粒。出芽后的新病毒颗粒仍然通过HA-SA键吸附于宿主细胞表面，经NA水解SA释放子代病毒，造成病毒的扩散与传播[5]。

抗流感病毒靶点及其抑制剂

预防和治疗流感，通常采用疫苗和抗流感化学药物。流感病毒不断地变异，常规疫苗可能难以预防治疗新病毒引发的流感大爆发，因此，抗流感化学药物研究具有非常重要的意义。总的来说，目前的抗流感化学药物有两个大的研究方向，分别针对流感病毒本身功能蛋白和宿主细胞潜在靶点。

基于宿主的抗流感病毒靶标及抑制剂

基于宿主的抗流感病毒靶标包括蛋白酶和囊泡质子ATP酶以及激酶等，然而这类药物对于非感染组织的潜在毒性还有待评价。

（1）蛋白酶前体蛋白HA0剪切位点的性质决定了能够剪切HA0的宿主蛋白酶类型，直接影响病毒嗜组织性和致病力。在高致病性H5和H7禽流感病毒中，HA0剪切位点含有多碱基序列，可被宿主细胞内广泛存在的碱性氨基酸蛋白酶或者PC6蛋白酶剪切，引起鸟类致死性的全身感染[6, 7]。然而，在一般的甲型流感病毒中，蛋白酶剪切位点表达的是单个精氨酸残基，只能被内蛋白酶识别，同时这种蛋白酶仅在鸟类肠道以及鸟类与哺乳动物的呼吸道中表达，极大地限制病毒在宿主体内的传播[8, 9]。事实上，如图3所示，已知的蛋白酶抑制剂，包括萘莫司他（Nafamostat）、卡莫司他（Camostat）等，均对甲、乙型流感病毒表现出较好的体内外选择性抑制作用[5]。

图3 蛋白酶及V-ATPase抑制剂

（2）囊泡质子ATP酶（V-ATPase）选择性V-ATPase抑制剂通过升高前溶酶体内部pH，从而抑制HA从非融合构象向融合构象的转化，进而实现病毒复制的抑制。针对该靶点的化合物有1994年报道的Norakin（如图3）。

针对流感病毒自身功能蛋白的靶点及抑制剂

该类化学药物根据病毒作用部位不同，可分为三大类，分别针对病毒核心（RdRP、NP）、病毒基质蛋白（M2）、病毒包膜突触（HA、NA），下面就它们的抑制剂作简单介绍。

（1）RdRP 流感病毒RdRP进化中高度保守，与哺乳动物的RNA聚合酶完全

不同，流感病毒RdRP同时具有复制酶和核酸内切酶活性。感染早期阶段，RdRP 以vRNA为模板合成mRNA，具有转录功能；病毒感染晚期，RdRP构象转变，以vRNA为模板合成互补的cRNA，再以合成的cRNA为模板合成vRNA,从而实现复制功能。RdRP由异三聚的PA、PB1、PB2三个亚基构成，也称为3P复合体。

PB1位于3P复合体的核心，其N端和C端分别与PA亚基的C端、PB2亚基N端相连，形成稳定蛋白复合物。PB1亚基通过不同构象结合vRNA或cRNA，分别合成mRNA（或cRNA）、vRNA，从而履行转录、复制功能。其构象的转换也是PB2帽子结合位点与内切酶活性位点激活的一个原因[10]。如图4所示，化合物A 是近年报道的靶向PB1的化合物，其IC

值为0.5 µM[11]。

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PB2亚基具有多重功能。首先，PB2亚基318-483位氨基酸残基区域能够与宿主mRNA引物帽结构结合[12]，从而启动转录过程。其次，PB2亚基C端678-757位氨基酸残基区域存在二重核定位信号（NSL），与RNA聚合酶通过核孔转运至细胞核内有关。第三，PB2亚基能够增强聚合酶复合物的稳定性，这可能是PB2亚基能够增强流感病毒对外界温度适应性的原因[13]。最后，研究发现PB2亚基R702、K627分别与病毒宿主选择性[14]、致病性[15]有密切关系。如图4所示，化合物B 为近年报道的靶向PB2的化合物，其抑制A/H3N2的IC

为7.5 µM[16]。

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图4 RdRP的抑制剂

PA也是3P复合体一个非常重要的亚基。Yuan[17]和Dias[18]分别在Mg2+、Mn2+存在下，获得了PA亚基N末端的晶体结构，验证了PA亚基内存在核酸内切酶活性位点，也表明该核酸内切酶具有双离子介导的作用机制。其次，PA亚基为磷酸化蛋白，1～247位氨基酸残基区域是其介导蛋白质水解的功能区，其水解活性与聚合酶活性呈正相关[19]。再者，PA亚基也能够与vRNA、cRNA启动子特异性