蛋白提取步骤

提蛋白及WB得步骤

整个过程细胞或蛋白都必须放冰上

准备工作：前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、

当天准备:洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记1、5ｍl 离心管及0、6ml离心

管、细胞刮板、开低温高速离心机

细胞裂解液配制:

1ml cｅll lysｉs

10ul NP-40（离心机后)

25uｌ焦磷酸钠

４0uｌNaF

１ul β-甘油磷酸

2 ul Na3VO4

1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱)

１0ul PＭSF(最后加，随加随用,有毒）

细胞裂解与收集

1.观察细胞状态,并准备提蛋白：吸走培养基、用ＰＢS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBＳ，左

右轻轻摇)，倾斜贴壁吸走ＰＢS。

2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐:一般1０6加0、1mｌ），冰上静置1-2

ｍｉn。

3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从

上往下全面刮，(刮得时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管.

细胞破碎

4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要

碰到离心管得壁与底部）

超声波设置:

工作功率5％工作时间3min

开机时间15ｓ,关机时间３０s

温度０度,

报警温度1度

5.４℃、1300０ｒ／ｍin,离心15min。(离心机用后一直保持打开得状态,）

蛋白保存

6.蛋白保存及分装:吸上清液至０、6ml离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。—80℃

保存。

注意事项：PＭSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30ｍin内就会降解一半.样品处理超过1ｈ，补加一次。

BCA测定蛋白浓度

1、测空白板，选差异较小得孔。

BCA测定法波长570,Bｒacfｏrd:595

2、标准蛋白得稀释(5mg/uｌ):分装1ml PBＳ来使用,稀释标准蛋白至０、5mg/ul。

取5uｌ标准蛋白＋45ul PBS

5、配BCA：每个孔２００ul，一个样品2个重复，Ａ:B=５0：１，根据样品数来计算BCA

得用量，一般防止损耗,多算一个样。

6、加BＣＡ:悬空加、37℃孵育3０mｉn。(手不能碰板得底部，影响测定结果）

7、计时３0miｎ

8、配分离胶，灌胶，加水封。

9、计时２0ｍiｎ．

10、测蛋白：先振板、再设置参数.

11、计算上样体积：

12、配浓缩胶,灌胶,加梳子，等1－2ｍｉn，出现缩胶得地方补上.

13、打开干式加热器

１0、蛋白质上样:根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度,以体积最大得为准，其她用水补足.（最大上样量为2０ｕl,除去buffer得体积，蛋白质最大上样体积为１6ul)

标记０、6ｍl离心管

加样顺序:水、buffer(１／4）、蛋白、离心—涡旋—离心。100℃变性１０mｉn(迅速,确保变性程度一致)

11、计时10miｎ，变性1０miｎ。

12、安装电泳槽：

电泳液(1X）：配制:９0mｌ(1０X)+8１0ｍｌ水(只能用一次）

液面刚覆盖胶，不能有气泡。

13、上样：maker 上样量为3ｕl. 依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板,笔直打进去

14、电泳

分离胶1０0V，20mｉn左右、条带都跑开即可。

浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。

转膜

准备工作:转移缓冲液(只能用２次)、三层滤纸、海绵、ＰVDF膜

PＶDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。

用海绵与滤纸之前先浸湿。

转膜：负极（黑板)海绵—三层滤纸-胶—PVＤF膜-三层滤纸—海绵－正极(白板).

三层滤纸与膜都需要赶气泡。

安装转移槽:加转子、冰盒,安装时夹子面朝上

１５、转膜电压100V 90mｉn。(视蛋白大小而定，蛋白分子小得可适当缩短时间)

１６、取膜晾干、剪个角作为标记,保鲜膜保存４℃。

孵育抗体

1、膜得活化:把膜晾干,甲醛浸泡(回收)膜数秒、无菌水洗３次、TBST洗２次。

2、封闭：配封闭液:3 % 得牛奶:４ｍl TBST+ 0、1２ｇ脱脂奶粉，混匀、涡旋。

3、4℃封闭一小时、盖盖子。

4、ＴBＳT 洗三次、每次1０mｉn ．(封闭液与一抗相同则不用洗)

5、一抗孵育：加一抗,1:1００0(比例视情况定）、密封孵育、盖盖子。

6、4℃过夜孵育。

7、回收一抗(回收到对应得离心管,立即放回4℃冰箱）

8、TBST洗三次、每次１0 min。

9、二抗孵育：加二抗，室温孵育1h。

10、回收二抗,ＴBSＴ洗3次,每次10 min（最后一次不要倒掉)（可以准备洗膜用得东西:

检查显影液就是否能用)

显影

11、准备显影得东西:显影液、镊子、剪刀、光片、保鲜膜、计时器、

配发光液：A：B 1：1、放小黑屋里。剪好保鲜膜、铺在板上,做好准备.

12、最后一次TBＳT洗完后,拿到小黑屋，关门、开红灯。

13、先剪Ｘ光片、右上角做个记号(位置瞧个人习惯),

１4、将膜上得液体吸干（卫生纸上稍微吸干)，放板上，定一个３mｉｎ计时器，加上发光液,开始计时．观察发光现象,当瞧到发光时，压片.

1５、压片:将膜反扣在保鲜膜上,不能产生气泡。每次压片都记时,先从2min开始。

1５。压片结束后,放在显影液里，轻轻摇晃至瞧到条带,用镊子夹至水中浸泡，清洗数秒,再放置定影液内。

16、等膜洗完后，拿至外间,用自来水清洗光片,晾干。