第12组-激活沉默基因以获取新型微生物次级代谢产物的策略研究

5 宿主细胞的遗传修饰改造
激活沉默基因 簇有时还需要 宿主细胞提供 合适的环境因 素, 因此对宿主 细胞进行遗传 修饰改造也是 必要的
例如
对一些模式微生物 的基因组 DNA 进 行规模化删减, 获得 适用于合成生物学 等研究的、含最小 基因组或缩减基因 组的宿主细胞。
[27] Chou WK, Fanizza I, Uchiyama T, et al. Genome mining in Streptomyces avermitilis: cloning and characterization of SAV_76, the synthase for a new sesquiterpene, avermitilol [J].J Am Chem Soc, 2010, 132: 8850−8851.
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5.核糖体工程策略
链霉素抗性突变
夫西地酸抗性突变
利福平抗性突变
new micreobial metabolites
[24] Xu J, Wang Y, Xie SJ, et al. Streptomyces xiamenensis sp.nov., a novel actinomycete isolated from a mangrove sediment sample[J].International Journal of Systematic and 17 Evolutionary Microbiology, 2009, 59: 472- 476.
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异源表达使得沉默基因在新的表达系统中无需按照原来的起始位点进行有效转 录，对培养条件也无特殊要求，克服了天然生产菌表达 水平低、遗传操作困难、 不容易规模培养等缺点，为工业化生产扫清障碍。另外，它还适用于生长缓慢 的微生物，如蓝细菌、真菌等。由该法已发现多种新的生物活性物质。
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实现天然产物异源表 达生物合成必须要解 决以下几个问题。
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6 单菌多次级代谢产物策略
单菌多次级代谢产物（one strain-many compounds，OSMAC）策略，是通过 改变培养培养基成分、通气量及添加重金属和酶抑制剂等发酵条件来获取更多新型 的次级代谢产物的方法
缺点：OSMAC 策略虽然有效， 但是其工作量 大，且最终能 否获得新的有 活性的次级代 谢产物并不确 定
取新型微生物天然产物 已经成为当务之急.
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沉默基因簇的异源表达
转录因子调控策略 表观遗传调控策略
5 宿主细胞的遗传修饰改造
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6 单菌多次级代谢产物策略
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核糖体工程策略
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1
沉默基因簇的异源表达
天然生产菌 表达水平低
遗传操作 困难
Hale Waihona Puke Baidu
生长缓慢
不容易规模 培养
不能应用于工业化生产
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所谓基因的异源表达，就是将整个沉默合成基因簇 克隆至质粒、黏粒或者细菌人工染色体上．利用异源宿 主对其进行表达，然后利用相关的分析技术对含有该克 隆的表达宿主以及对照宿主的发酵液上清或者提取物进 行分析，最终对该代谢产物进行分离、纯化和结构鉴定。
这种方法的优点是产物是立即归于目标基因簇和产量增加的潜 能，但不适用于受翻译后调控的转录因子和不包含转录因子的 基因。 [14]Chiang YM,Szewczyk E,Davidson AD,et al.A gene cluster containing two fungal polyketide synthases encodes the biosynthetic pathway for a polyketide, 13 asperfuranone in Aspergillus nidulans[J]. J Am Chem Soc.,2009,131(8):2965-
激活沉默基因以获取新型微生物次 级代谢产物的策略研究
组员： 季宗德 郭秋香 张羡媛
赵琪
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一直以来，天然产物在人类疾病的治疗过程中发挥着重 要作用。
根据2007 年的统计，1981～2006 年间国际上所有批 准的药物中，超过 50%来源于天然产物、天然产物的衍生物 或模拟天然产物药效基团的合成化合物。 尤其是，目前临 床上使用的 60%的抗癌药物和 70%的抗生素是天然产物或 者基于天然产物研发的药物。
遗传途径 的转移
功能基因 表达
蛋白活性
对宿主细 胞的影响
良好的异源表达宿主：链霉菌、大肠埃希菌、 枯草芽孢杆菌、假单胞菌和黄色粘球菌
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转录因子调控策略
启动子的 替换
转录因子 调控策略 正调节基 因进行组 成型表达 负调节基 因的中断
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正调节基因进行组成型表达和负调节基因的中断
沉默基因簇中含有的正调节基因和负调节基因，控制次级代谢产物生物合 成的开关。对正调节基因进行组成型表达或对负调节基因进行阻断, 可以激活 沉默基因簇, 获得微生物新型次级代谢产物。 Laureti 等对生二素链霉菌的不转 录表达的途径特异性正调节基因 samR0484进行组成型表达后，激 活了沉默基因簇, 最终得到新型天 然产物stambomycins，并可能成 为抗肿瘤药物开发的先导化合物。
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表观遗传调控策略 染色体中 DNA 序 列 不改变
通过 通过
DNA 甲基化
组蛋白 修饰
染色体 重塑
非编码 RNA
将相关的染色质构型改变，激活沉默基因的表达14
组蛋白去乙酰化酶 组蛋白乙酰基转移 酶
[17] Henrikson JC,Hoover AR,Joyner PM,Cichewicz RH. A chemical epigenetics approach for engineering the in situ biosynthesis of a cryptic natural product from Aspergillusniger[J]. nygeroneA Organic ＆ Biomolecular Chemistry,2009,7(3):435-438. 15
微生物基因 组测序 我们有理由相信，
生物信息学和 代谢组学
越来越多的沉默基因将被发掘，我们也 将进入通过激活微生物的沉默基因来获 得新的生物活性天然产物的黄金时代， 并为临床研制更多治愈复杂疾病的新药。
分离纯化和鉴 定技术手段
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中国科学家更是于 2009 年 发起了“万种微生物基因组” 计划，预计在3年内完成1万 种微生物物种全基因组序列 图谱的构建。
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在常规培养条件下，大 多数生物合成基因簇不表 达或以极低水平表达并在 沉默生物合成基因簇包含了 特定条件下被激活而表达 多种结构类型的微生物次级代谢 活性产物，这些 DNA序列称 产物编码信息, 提供了丰富的合 为沉默生物合成基因簇。 因此，如何利用现有 成生物学天然元件或模块 , 并为 未来设计和构建新型微生物次级 的研究成果和技术手段 代谢产物生物合成途径提供丰富 进行激活沉默基因以获 的物质基础。
从微生物中发现和分离新型化合物是发展新型药物的 主要方向之一.
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非常值得思考的问题：
随着大量微生物次级代谢产物的分离,从 自然界直接分离具有新结构、新活性化合物 变得越来越困难。
临床上病原微生物的耐药性日益严重， 艾滋病、禽流感等新型疾病不断出现，我 们亟需新的研发策略发现新型天然药物。
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随着基因组测序技术 的飞速发展和微生物基因 组大规模测序的广泛开展， 目前已测定了超过580个 微生物的全基因组序列。
核糖体工程是指程通过对微生物次级代谢产物合成相关基因表达 的两个重要元件——核糖体或RNA 聚合酶进行修饰和改造，以抗 生素抗性突变为外在特征，向其合成相关基因中引入特定的点突 变或缺失突变，核糖体结构的改变引起蛋白合成能力的改变，进 而激活沉默基因，影响微生物次级代谢产物的合成。
其操作简单，无需了解遗传背景，易于与其他改良方法联合使用而被广泛引用。
余贞等中断变铅青链霉菌的负调控 基因nsdA，最终合成放线紫红素。
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启动子的替换
在适合于分子遗传操作的微生物中，许多次级代谢生物 合成基因簇含有一个或者多个能够控制整个基因簇转录 的转录因子。 将可诱导的启动子替换原有转录因子的天然启动子， 转录不再受原有的微生物控制，同时新的启动子能够 使转录因子高水平表达，反过来又激活整个沉默基因 簇的表达。
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核糖体工程策略
核糖体是蛋白质的合成机器, 也是细胞感知营养水平和对生长速率进行调控的重要位点。 在稳定生长期, 与次级代谢产物生物合成相关基因的大量表达取决于此时核糖体的功能。 因此核糖体突变( 包括核糖体蛋白和 rRNA) 带来的蛋白合成能力的改变, 对次级代谢产 物生物合成的影响必然是十分深刻的。
[21] Banskota AH,McAlpine JB,Srensen D,et al.Isolation and identification of three new 5-Alkenyl19 3,3 (2H) - furanones from two streptomyces species using a genomic screening approach[J].The