关于原核生物的基因表达与操作
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关于原核生物的基 因表达与操作
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
重组基因表达的目的
1. 蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产 3. 疾病的基因治疗 4. 食品、化工用酶制剂 5. 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集
3.融合蛋白表达载体系统
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋 白连接在一起的。 如：pGEX、pET系列
优点：便于融合蛋白的分离和纯化。
组成结构： 1）启动子：tac 2）操纵基因：lacP 3）调节基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）
➢ 融合蛋白表达系统的构建的三个原则：
➢ 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否 已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也 可用来同任何一种目的启动子连接，因此其 表达活性可作为检测启动子功能的依据。
常用的可调控启动子
➢ Lac(乳糖启动子) ➢ Trp(色氨酸启动子) ➢ Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) ➢ PL (λ噬菌体的左向启动子) ➢ T7噬菌体启动子
➢ 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因mRNA稳定性。
➢ 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
➢ 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。
➢ 受控于温度敏感的阻遏蛋白cI 。在低温(28-30℃) 时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高 温(42℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使 PL启动子转录。
常用大肠杆菌表达载体
1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体 1）强启动子: tac（trp-lac） trp的-35区
重组基因表达体系
➢大肠杆菌 ➢枯草杆菌
1. 原核体系 ➢乳酸菌
➢沙门氏杆菌 ➢苏云金杆菌
➢酵母细胞
2. 真核体系 ➢昆虫细胞
➢植物细胞、组织 ➢动物细胞、组织
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系优越性：
➢ 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；
➢ 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；
lacUV5的-10区
2）操纵基因：乳糖操纵子系统
lac操纵基因
3）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
条件： 必须选择一个有
lacI的宿主菌。
非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或C端不含任 何其他氨基酸。
所表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起 始，在其氨基端不含细菌多肽序列。
➢ 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；
➢ 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产。
大肠杆菌中表达体系的不足：
➢ 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。
➢ 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。
5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
➢ 原核生物基因表达载体的组成特征
启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子
大肠杆菌表达载体
核糖体结合位点
启动子
转录终止子
➢ 报告基因（reporter gene）：特指那些编 码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单 元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤 光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙 酰转移酶基因等）。
非融合蛋白特点：
➢ 表达时要求高：SD序列与ATG的距离要 合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也 会大受影响。
➢ 优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。 ➢ 缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降
解，蛋白产量低；分离纯化费时费力， 成本较高。
2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一
阻遏蛋白的结合，提高转录活性。
Tac启动子
➢ 是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动 子，其启动能力比Lac和trp都强；
➢ 受Lac阻遏蛋白的负调节，受IPTG（异丙基硫代 半乳糖苷）的诱导 。
λ噬菌体的左向启动子PL
➢ 来自λ噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启 动子高约11倍；
起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。
pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,
1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。
2）调节基因：lac I 。
3）S-D序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。
通过与阻遏蛋白的相互作用来控制基因的启动和停止
大肠杆菌的Lac启动子
➢ 来自大肠杆菌的乳糖操纵子 ➢ 由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)
和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成 ➢ 受活化蛋白和cAMP 的正调控，阻遏蛋白的负调控 ➢ 受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳
➢重组基因在原核细胞中表达具备条件
1.通过表达载Fra Baidu bibliotek将外源基因导入宿主菌，并指导 宿主菌的酶系统合成外源蛋白。
2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必 须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。
3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控 元件控制外源基因的表达。
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的 开放阅读框架(ORF)。
糖苷）、ONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导 ➢ LacUV5启动子：Lac启动子的衍生物
大肠杆菌的trp启动子
➢ 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 ➢ 由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构
基因组成 ➢ 受阻遏蛋白和衰减子的调控，阻遏蛋白前体必须
与色氨酸结合才有活性 ➢ 3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可竞争性抑制色氨酸与
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
重组基因表达的目的
1. 蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产 3. 疾病的基因治疗 4. 食品、化工用酶制剂 5. 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集
3.融合蛋白表达载体系统
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋 白连接在一起的。 如：pGEX、pET系列
优点：便于融合蛋白的分离和纯化。
组成结构： 1）启动子：tac 2）操纵基因：lacP 3）调节基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）
➢ 融合蛋白表达系统的构建的三个原则：
➢ 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否 已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也 可用来同任何一种目的启动子连接，因此其 表达活性可作为检测启动子功能的依据。
常用的可调控启动子
➢ Lac(乳糖启动子) ➢ Trp(色氨酸启动子) ➢ Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) ➢ PL (λ噬菌体的左向启动子) ➢ T7噬菌体启动子
➢ 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因mRNA稳定性。
➢ 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
➢ 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。
➢ 受控于温度敏感的阻遏蛋白cI 。在低温(28-30℃) 时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高 温(42℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使 PL启动子转录。
常用大肠杆菌表达载体
1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体 1）强启动子: tac（trp-lac） trp的-35区
重组基因表达体系
➢大肠杆菌 ➢枯草杆菌
1. 原核体系 ➢乳酸菌
➢沙门氏杆菌 ➢苏云金杆菌
➢酵母细胞
2. 真核体系 ➢昆虫细胞
➢植物细胞、组织 ➢动物细胞、组织
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系优越性：
➢ 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；
➢ 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；
lacUV5的-10区
2）操纵基因：乳糖操纵子系统
lac操纵基因
3）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
条件： 必须选择一个有
lacI的宿主菌。
非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或C端不含任 何其他氨基酸。
所表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起 始，在其氨基端不含细菌多肽序列。
➢ 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；
➢ 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产。
大肠杆菌中表达体系的不足：
➢ 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。
➢ 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。
5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
➢ 原核生物基因表达载体的组成特征
启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子
大肠杆菌表达载体
核糖体结合位点
启动子
转录终止子
➢ 报告基因（reporter gene）：特指那些编 码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单 元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤 光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙 酰转移酶基因等）。
非融合蛋白特点：
➢ 表达时要求高：SD序列与ATG的距离要 合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也 会大受影响。
➢ 优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。 ➢ 缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降
解，蛋白产量低；分离纯化费时费力， 成本较高。
2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一
阻遏蛋白的结合，提高转录活性。
Tac启动子
➢ 是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动 子，其启动能力比Lac和trp都强；
➢ 受Lac阻遏蛋白的负调节，受IPTG（异丙基硫代 半乳糖苷）的诱导 。
λ噬菌体的左向启动子PL
➢ 来自λ噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启 动子高约11倍；
起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。
pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,
1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。
2）调节基因：lac I 。
3）S-D序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。
通过与阻遏蛋白的相互作用来控制基因的启动和停止
大肠杆菌的Lac启动子
➢ 来自大肠杆菌的乳糖操纵子 ➢ 由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)
和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成 ➢ 受活化蛋白和cAMP 的正调控，阻遏蛋白的负调控 ➢ 受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳
➢重组基因在原核细胞中表达具备条件
1.通过表达载Fra Baidu bibliotek将外源基因导入宿主菌，并指导 宿主菌的酶系统合成外源蛋白。
2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必 须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。
3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控 元件控制外源基因的表达。
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的 开放阅读框架(ORF)。
糖苷）、ONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导 ➢ LacUV5启动子：Lac启动子的衍生物
大肠杆菌的trp启动子
➢ 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 ➢ 由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构
基因组成 ➢ 受阻遏蛋白和衰减子的调控，阻遏蛋白前体必须
与色氨酸结合才有活性 ➢ 3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可竞争性抑制色氨酸与