肿瘤相关中性粒细胞促进人骨肉瘤细胞SOSP-9607迁移及其作用机制
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现代肿瘤医学 ２０１８年 ０３月 第 ２６卷第 ０６期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｒ２０１８，ＶＯＬ２６，ＮＯ０６
·８１３·
?论 著? ?基础研究?
肿瘤相关中性粒细胞促进人骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７迁移及其作用机制
杨童磊，刘 涛，马 琼，裘秀春，刘云燕，文艳华，马保安
ＴｕｍｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｍｉｇｒａｔｉΒιβλιοθήκη BaiduｎｏｆｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓＳＯＳＰ －９６０７ａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｕｍｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｏｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｅｘｔｅｎｔｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｉｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗａｓｓｔｕｄ ｉｅｄｂｙＨＥａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ．ＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓＳＯＳＰ－９６０７， ａｎｄｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＳＯＳＰ－９６０７ｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｗｅｒｅｍｏｎｉｔｏｒｅｄｕｓｉｎｇ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｆｔｅｒｃｏ－ｃｕｌ ｔｕｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＨＥａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｏｓｔｅｏ ｓａｒｃｏｍａｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＳＯＳＰ－９６０７ｃｅｌｌｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄｗｈｅｎｔｈｅｙｗｅｒｅｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．ＣｙｔｏｋｉｎｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＩＬ－６，ＩＬ－１β， Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ，ＩＧＦＢＰ－１ａｎｄｏｔｈｅｒｃｙｔｏｋｉｎｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｃａｎｐｒｏｍｏｔｅＳＯＳＰ －９６０７ｍｉｇｒａｔｉｏｎｗｈｅｎｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＳＯＳＰ－９６０７ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｌｉｋｅｌｙｔｏｂｅａｃｈｉｅｖｅｄｖｉａａｖａｒｉｅｔｙｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｓｕｃｈａｓＩＬ－６，ＩＬ－１β，ＡｎｇｉｏｇｅｎｉｎａｎｄＩＧＦＢＰ－１． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ，ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ
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杨童磊，等 肿瘤相关中性粒细胞促进人骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７迁移及其作用机制
瘤微环境主要由增殖的肿瘤细胞、细胞间质、血管、浸润的炎 症细胞以及来源于肿瘤细胞和肿瘤基质细胞的趋化因子、细 胞因子和生长因子等构成［４］。免疫细胞通过分泌各种细胞 因子对肿瘤的发生与发展起着至关重要的作用。而中性粒 细胞（Ｎｅｕ）作 为 免 疫 细 胞 的 一 种，约 占 循 环 中 白 细 胞 的 ６０％。我们把浸润 在 肿 瘤 微 环 境 中 的 中 性 粒 细 胞 称 为 肿 瘤 相关中性粒细胞［５］。肿瘤相关中性粒细胞对机体具有两面 性，其抑制肿瘤进展和促进肿瘤转移两方面作用在文献中均 有报道。传统观念认为中性粒细胞作为机体防御性免疫的 一部分具有抑制肿瘤的作用 。 ［６，７］ 但是，越来越多的临床观 察和实验室研究表明，中性粒细胞在肿瘤组织中的出现与不 良预后具有显著的相关性 。 ［８－１１］ 本实验拟以中性粒细胞与 骨肉瘤细胞共培养模拟肿瘤微环境中中性粒细胞与骨肉瘤 细胞的相互作用，研究中性粒细胞与骨肉瘤进展转移之间的关 系，阐明中性粒细胞在骨肉瘤转移过程中发挥的具体作用。 １ 材料与方法 １．１ 材料
ＹａｎｇＴｏｎｇｌｅｉ，ＬｉｕＴａｏ，ＭａＱｉｏｎｇ，ＱｉｕＸｉｕｃｈｕｎ，ＬｉｕＹｕｎｙａｎ，ＷｅｎＹａｎｈｕａ，ＭａＢａｏａｎ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＯｎｃｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰＬＡ，ＴａｎｇｄｕＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＳｈａａｎｘｉＸｉ＇ａｎ７１００３８， Ｃｈｉｎａ．
【收稿日期】 ２０１７－０９－１３ 【修回日期】 ２０１７－１０－１３ 【基金项目】 国家自然科学基金（编号：８１３７２２９７） 【作者单位】 第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所，陕西 西安
７１００３８ 【作者简介】 杨童磊 （１９９２－），男，陕 西 西 安 人，在 读 硕 士 研 究 生，
主要从 事 骨 肿 瘤 基 础 及 临 床 相 关 研 究。 Ｅ－ｍａｉｌ： ｘｙｙａｎｇｈａｎｇ＠１６３．ｃｏｍ 【通讯作者】 马保安（１９６１－），男，吉林长春人，主任医师，教授，博 士生导师，主 要 从 事 骨 肿 瘤 外 科、创 伤 骨 科 及 人 工 关 节外科相关研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｋｅｍｂａ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
人骨肉瘤细胞系 ＳＯＳＰ－９６０７来自于空军军医大学（原 第四军医大学）唐都医院骨肿瘤研究所。５例血液样本来自 唐都医院骨科 ２０１６年 １０月至 ２０１７年 ３月入院的骨肉瘤患 者，所有病例均经影像及病理组织学检查明确。患者无高血 压、心脏病、传染性疾病病史，尚未接受化疗。患者均签署知 情同意书，该方案经唐都医院医学伦理委员会通过。
应用 ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行相关数据分析，采用卡方 检验及成组方差分析进行统计分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计 学意义。 ２ 结果 ２．１ ＨＥ和免疫组化染色结果
ＤＭＥＭ培养基购自 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，胎牛血清购自杭州四 季青生物工程有限公司，ＣＤ１５抗体（ａｂ１７２７２９）购自 ａｂｃａｍ 公司，ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰ多功能实时无标记细胞分析仪 由罗氏公 司 提 供，细 胞 因 子 芯 片 ＡＡＨ －ＣＹＴ－５－４购 自 ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ公司，中性粒细胞分离液购自天津市灏洋生物制 品科技有限责任公司。 １．３ 实验方法 １．３．１ 免疫组织化学 ＳＰ法 采用免疫组织化学 ＳＰ法检测 肿瘤组织内 ＣＤ１５阳性的中性粒细胞。取石蜡包埋组织，连 续切片，切片厚 ５μｍ。脱蜡至水，ＰＢＳ冲洗，３％过氧化氢甲 醇溶液封闭 ２０ｍｉｎ，加羊血清 ３０ｍｉｎ后，滴加 ＣＤ１５单克隆 抗体（ａｂ１７２７２９）４℃孵育过夜。ＰＢＳ冲洗后滴加兔抗 Ｉｇｃ－ ＨＲＰ，用 ＤＡＢ显色，水洗，苏木精复染。 １．３．２ 细 胞 培 养 人 骨 肉 瘤 细 胞 系 ＳＯＳＰ－９６０７用 含 有 １０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养基，置于 ３７％、５％ ＣＯ２ 饱和湿 度的培养箱中培养。 １．３．３ 中性粒细胞分离 取一支 １５ｍｌ离心管，加入 ５ｍｌ 试剂 Ａ。用吸管小心吸取血液样本加于分离液的液面上， ４５０×ｇ，离心 ２５ｍｉｎ，离心后，离心管中出现两层环状乳白色 细胞层，用吸 管 小 心 吸 取 分 离 液 中 位 于 下 层 的 中 性 粒 细 胞 层。加入 ５ｍｌ红细胞裂解液，裂解 ２ｍｉｎ后，离心，重悬，反 复三次，得到中性粒细胞备用。 １．３．４ 细胞共培养 取对数生长期人骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－ ９６０７按照不同比例混合提取好的中性粒细胞，用无血清培养
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０１８，２６（０６）：０８１３－０８１７
【摘要】 目的：研究肿瘤相关中性粒细胞对人骨肉瘤细胞迁移能力的影响及可能的机制。方法：ＨＥ和免疫 组化染色检测骨肉瘤临床标本中中性粒细胞浸润程度；中性粒细胞与人骨肉瘤细胞系 ＳＯＳＰ－９６０７共培养， ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰ多功能实时无标记细胞分析仪监测不同比例中性粒细胞对 ＳＯＳＰ－９６０７细胞迁移能力 的影响；细胞因子芯片检测中性粒细胞与人骨肉瘤细胞系 ＳＯＳＰ－９６０７共培养后细胞因子变化情况。结果： 在临床转移骨肉瘤标本中 ＨＥ和免疫组化染色均显示肿瘤组织内存在中性粒细胞的浸润；ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡ ＤＰ多功能实时无标记细胞分析仪监测显示，骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７和人外周血中性粒细胞共培养后细胞 迁移能力明显增强于对照组；细胞因子芯片检测发现 ＩＬ－６、ＩＬ－１β、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１等多个细胞因子明 显增高。结论：人骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７和肿瘤相关中性粒细胞共培养，中性粒细胞能够促进 ＳＯＳＰ－９６０７ 细胞的迁移，而这种促进作用很可能是通过 ＩＬ－６、ＩＬ－１β、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１等多种细胞因子实现的。 【关键词】骨肉瘤；肿瘤相关中性粒细胞；细胞因子 【中图分类号】Ｒ７３８．１ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０１８．０６．００１ 【文章编号】１６７２－４９９２－（２０１８）０６－０８１３－０５
骨肉瘤是青少年最常见的原发性间叶组织肿瘤，也是严 重危害青少年身体健康的恶性骨肿瘤。骨肉瘤发病率约为 （６～８）／１００万，且多发于青少年，近年来发病率有逐年增加 的趋势［１，２］。由于骨肉瘤侵袭性强，主要经血液转移，肺部转 移往往发生较早。超过 ８０％仅表现为原位肿瘤的骨肉瘤病 患在行截肢手术后仍发生转移，大多数的骨肉瘤患者在诊断 时已具有微小转移灶，故预后较差，５年存活率在 ７０％左右。 近十几年骨肉瘤患者的生存率并无显著性提升，仍是严重危 害青少年身体健康最常见的原发性恶性骨肿瘤［３］。 肿瘤转移是影响肿瘤治疗效果以及致肿瘤患者死亡的 首要原因，而肿瘤微环境与肿瘤的发生和转移密不可分。肿
收集了 ２００５年至 ２０１６年第四军医大学第二附属医院 骨肿瘤研究中心骨肉瘤患者石蜡组织标本共计 ２４例，并收 集了病人的临床资料，其中骨肉瘤患者男性标本 １５例，女性 标本 ９例，年龄分布从 ８岁至 ４２岁，平均年龄为 １８岁。死亡 及转移病例 １１例，未见明确转移病例 １３例。 １．２ 主要试剂与仪器
基调 整 ＳＯＳＰ－９６０７细 胞 密 度 为 ５×１０５／ｍｌ。 将 对 照 组 （ＳＯＳＰ－９６０７组、中性粒细胞组）以及实验组（中性粒细胞与 ＳＯＳＰ－９６０７细胞共培养组，骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７与中性 粒细胞数比例分别为 １∶１、２∶１及 ３∶１）共 ５组细胞种植于迁 移小室内，进行 ４８ｈ实时监测，ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰ多功 能实时无标记细胞分析仪动态监测细胞生理功能相关的生 物信息，包括细胞迁移和浸润检测、细胞间共培养检测、细胞 的生长增殖检测等指标。 １．３．５ 细胞因子芯片检测 将细胞分为四组，实验组 Ａ、Ｂ 为骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７与中性粒细胞数比例分别为 １∶１ 与 ３∶１共培养，对照组 Ｃ为单独的骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７， 对照组 Ｄ为单独的中性粒细胞。细胞培养 ４８ｈ后，将共培 养后的 ＳＯＳＰ－９６０７细胞用 ０．２５％胰蛋白酶消化，ＰＢＳ洗涤， １５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ离 心 并 收 集。 取 培 养 上 清 离 心，ＰＢＳ洗 涤，再次离心得到悬浮的中性粒细胞。将所得肿瘤相关中性 粒细胞裂解，测定蛋白浓度，膜芯片用封闭缓冲液封闭 １ｈ后 加样，４℃过夜振荡孵育，清洗液清洗三次，生物素抗体室温孵育 ２ ｈ，清洗液清洗三次，ＨＲＰ－链霉亲和素室温避光振荡孵育 ２ ｈ，ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００化学发光成像分析系统进行分析。 １．４ 统计学方法
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?论 著? ?基础研究?
肿瘤相关中性粒细胞促进人骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７迁移及其作用机制
杨童磊，刘 涛，马 琼，裘秀春，刘云燕，文艳华，马保安
ＴｕｍｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｍｉｇｒａｔｉΒιβλιοθήκη BaiduｎｏｆｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓＳＯＳＰ －９６０７ａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｕｍｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｏｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｅｘｔｅｎｔｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｉｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗａｓｓｔｕｄ ｉｅｄｂｙＨＥａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ．ＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓＳＯＳＰ－９６０７， ａｎｄｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＳＯＳＰ－９６０７ｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｗｅｒｅｍｏｎｉｔｏｒｅｄｕｓｉｎｇ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｆｔｅｒｃｏ－ｃｕｌ ｔｕｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＨＥａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｏｓｔｅｏ ｓａｒｃｏｍａｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＳＯＳＰ－９６０７ｃｅｌｌｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄｗｈｅｎｔｈｅｙｗｅｒｅｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．ＣｙｔｏｋｉｎｅｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＩＬ－６，ＩＬ－１β， Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ，ＩＧＦＢＰ－１ａｎｄｏｔｈｅｒｃｙｔｏｋｉｎｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｃａｎｐｒｏｍｏｔｅＳＯＳＰ －９６０７ｍｉｇｒａｔｉｏｎｗｈｅｎｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＳＯＳＰ－９６０７ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｌｉｋｅｌｙｔｏｂｅａｃｈｉｅｖｅｄｖｉａａｖａｒｉｅｔｙｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｓｕｃｈａｓＩＬ－６，ＩＬ－１β，ＡｎｇｉｏｇｅｎｉｎａｎｄＩＧＦＢＰ－１． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ，ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ
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杨童磊，等 肿瘤相关中性粒细胞促进人骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７迁移及其作用机制
瘤微环境主要由增殖的肿瘤细胞、细胞间质、血管、浸润的炎 症细胞以及来源于肿瘤细胞和肿瘤基质细胞的趋化因子、细 胞因子和生长因子等构成［４］。免疫细胞通过分泌各种细胞 因子对肿瘤的发生与发展起着至关重要的作用。而中性粒 细胞（Ｎｅｕ）作 为 免 疫 细 胞 的 一 种，约 占 循 环 中 白 细 胞 的 ６０％。我们把浸润 在 肿 瘤 微 环 境 中 的 中 性 粒 细 胞 称 为 肿 瘤 相关中性粒细胞［５］。肿瘤相关中性粒细胞对机体具有两面 性，其抑制肿瘤进展和促进肿瘤转移两方面作用在文献中均 有报道。传统观念认为中性粒细胞作为机体防御性免疫的 一部分具有抑制肿瘤的作用 。 ［６，７］ 但是，越来越多的临床观 察和实验室研究表明，中性粒细胞在肿瘤组织中的出现与不 良预后具有显著的相关性 。 ［８－１１］ 本实验拟以中性粒细胞与 骨肉瘤细胞共培养模拟肿瘤微环境中中性粒细胞与骨肉瘤 细胞的相互作用，研究中性粒细胞与骨肉瘤进展转移之间的关 系，阐明中性粒细胞在骨肉瘤转移过程中发挥的具体作用。 １ 材料与方法 １．１ 材料
ＹａｎｇＴｏｎｇｌｅｉ，ＬｉｕＴａｏ，ＭａＱｉｏｎｇ，ＱｉｕＸｉｕｃｈｕｎ，ＬｉｕＹｕｎｙａｎ，ＷｅｎＹａｎｈｕａ，ＭａＢａｏａｎ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＯｎｃｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰＬＡ，ＴａｎｇｄｕＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＳｈａａｎｘｉＸｉ＇ａｎ７１００３８， Ｃｈｉｎａ．
【收稿日期】 ２０１７－０９－１３ 【修回日期】 ２０１７－１０－１３ 【基金项目】 国家自然科学基金（编号：８１３７２２９７） 【作者单位】 第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所，陕西 西安
７１００３８ 【作者简介】 杨童磊 （１９９２－），男，陕 西 西 安 人，在 读 硕 士 研 究 生，
主要从 事 骨 肿 瘤 基 础 及 临 床 相 关 研 究。 Ｅ－ｍａｉｌ： ｘｙｙａｎｇｈａｎｇ＠１６３．ｃｏｍ 【通讯作者】 马保安（１９６１－），男，吉林长春人，主任医师，教授，博 士生导师，主 要 从 事 骨 肿 瘤 外 科、创 伤 骨 科 及 人 工 关 节外科相关研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｋｅｍｂａ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
人骨肉瘤细胞系 ＳＯＳＰ－９６０７来自于空军军医大学（原 第四军医大学）唐都医院骨肿瘤研究所。５例血液样本来自 唐都医院骨科 ２０１６年 １０月至 ２０１７年 ３月入院的骨肉瘤患 者，所有病例均经影像及病理组织学检查明确。患者无高血 压、心脏病、传染性疾病病史，尚未接受化疗。患者均签署知 情同意书，该方案经唐都医院医学伦理委员会通过。
应用 ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行相关数据分析，采用卡方 检验及成组方差分析进行统计分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计 学意义。 ２ 结果 ２．１ ＨＥ和免疫组化染色结果
ＤＭＥＭ培养基购自 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，胎牛血清购自杭州四 季青生物工程有限公司，ＣＤ１５抗体（ａｂ１７２７２９）购自 ａｂｃａｍ 公司，ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰ多功能实时无标记细胞分析仪 由罗氏公 司 提 供，细 胞 因 子 芯 片 ＡＡＨ －ＣＹＴ－５－４购 自 ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ公司，中性粒细胞分离液购自天津市灏洋生物制 品科技有限责任公司。 １．３ 实验方法 １．３．１ 免疫组织化学 ＳＰ法 采用免疫组织化学 ＳＰ法检测 肿瘤组织内 ＣＤ１５阳性的中性粒细胞。取石蜡包埋组织，连 续切片，切片厚 ５μｍ。脱蜡至水，ＰＢＳ冲洗，３％过氧化氢甲 醇溶液封闭 ２０ｍｉｎ，加羊血清 ３０ｍｉｎ后，滴加 ＣＤ１５单克隆 抗体（ａｂ１７２７２９）４℃孵育过夜。ＰＢＳ冲洗后滴加兔抗 Ｉｇｃ－ ＨＲＰ，用 ＤＡＢ显色，水洗，苏木精复染。 １．３．２ 细 胞 培 养 人 骨 肉 瘤 细 胞 系 ＳＯＳＰ－９６０７用 含 有 １０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养基，置于 ３７％、５％ ＣＯ２ 饱和湿 度的培养箱中培养。 １．３．３ 中性粒细胞分离 取一支 １５ｍｌ离心管，加入 ５ｍｌ 试剂 Ａ。用吸管小心吸取血液样本加于分离液的液面上， ４５０×ｇ，离心 ２５ｍｉｎ，离心后，离心管中出现两层环状乳白色 细胞层，用吸 管 小 心 吸 取 分 离 液 中 位 于 下 层 的 中 性 粒 细 胞 层。加入 ５ｍｌ红细胞裂解液，裂解 ２ｍｉｎ后，离心，重悬，反 复三次，得到中性粒细胞备用。 １．３．４ 细胞共培养 取对数生长期人骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－ ９６０７按照不同比例混合提取好的中性粒细胞，用无血清培养
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０１８，２６（０６）：０８１３－０８１７
【摘要】 目的：研究肿瘤相关中性粒细胞对人骨肉瘤细胞迁移能力的影响及可能的机制。方法：ＨＥ和免疫 组化染色检测骨肉瘤临床标本中中性粒细胞浸润程度；中性粒细胞与人骨肉瘤细胞系 ＳＯＳＰ－９６０７共培养， ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰ多功能实时无标记细胞分析仪监测不同比例中性粒细胞对 ＳＯＳＰ－９６０７细胞迁移能力 的影响；细胞因子芯片检测中性粒细胞与人骨肉瘤细胞系 ＳＯＳＰ－９６０７共培养后细胞因子变化情况。结果： 在临床转移骨肉瘤标本中 ＨＥ和免疫组化染色均显示肿瘤组织内存在中性粒细胞的浸润；ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡ ＤＰ多功能实时无标记细胞分析仪监测显示，骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７和人外周血中性粒细胞共培养后细胞 迁移能力明显增强于对照组；细胞因子芯片检测发现 ＩＬ－６、ＩＬ－１β、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１等多个细胞因子明 显增高。结论：人骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７和肿瘤相关中性粒细胞共培养，中性粒细胞能够促进 ＳＯＳＰ－９６０７ 细胞的迁移，而这种促进作用很可能是通过 ＩＬ－６、ＩＬ－１β、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１等多种细胞因子实现的。 【关键词】骨肉瘤；肿瘤相关中性粒细胞；细胞因子 【中图分类号】Ｒ７３８．１ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０１８．０６．００１ 【文章编号】１６７２－４９９２－（２０１８）０６－０８１３－０５
骨肉瘤是青少年最常见的原发性间叶组织肿瘤，也是严 重危害青少年身体健康的恶性骨肿瘤。骨肉瘤发病率约为 （６～８）／１００万，且多发于青少年，近年来发病率有逐年增加 的趋势［１，２］。由于骨肉瘤侵袭性强，主要经血液转移，肺部转 移往往发生较早。超过 ８０％仅表现为原位肿瘤的骨肉瘤病 患在行截肢手术后仍发生转移，大多数的骨肉瘤患者在诊断 时已具有微小转移灶，故预后较差，５年存活率在 ７０％左右。 近十几年骨肉瘤患者的生存率并无显著性提升，仍是严重危 害青少年身体健康最常见的原发性恶性骨肿瘤［３］。 肿瘤转移是影响肿瘤治疗效果以及致肿瘤患者死亡的 首要原因，而肿瘤微环境与肿瘤的发生和转移密不可分。肿
收集了 ２００５年至 ２０１６年第四军医大学第二附属医院 骨肿瘤研究中心骨肉瘤患者石蜡组织标本共计 ２４例，并收 集了病人的临床资料，其中骨肉瘤患者男性标本 １５例，女性 标本 ９例，年龄分布从 ８岁至 ４２岁，平均年龄为 １８岁。死亡 及转移病例 １１例，未见明确转移病例 １３例。 １．２ 主要试剂与仪器
基调 整 ＳＯＳＰ－９６０７细 胞 密 度 为 ５×１０５／ｍｌ。 将 对 照 组 （ＳＯＳＰ－９６０７组、中性粒细胞组）以及实验组（中性粒细胞与 ＳＯＳＰ－９６０７细胞共培养组，骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７与中性 粒细胞数比例分别为 １∶１、２∶１及 ３∶１）共 ５组细胞种植于迁 移小室内，进行 ４８ｈ实时监测，ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡＤＰ多功 能实时无标记细胞分析仪动态监测细胞生理功能相关的生 物信息，包括细胞迁移和浸润检测、细胞间共培养检测、细胞 的生长增殖检测等指标。 １．３．５ 细胞因子芯片检测 将细胞分为四组，实验组 Ａ、Ｂ 为骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７与中性粒细胞数比例分别为 １∶１ 与 ３∶１共培养，对照组 Ｃ为单独的骨肉瘤细胞 ＳＯＳＰ－９６０７， 对照组 Ｄ为单独的中性粒细胞。细胞培养 ４８ｈ后，将共培 养后的 ＳＯＳＰ－９６０７细胞用 ０．２５％胰蛋白酶消化，ＰＢＳ洗涤， １５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ离 心 并 收 集。 取 培 养 上 清 离 心，ＰＢＳ洗 涤，再次离心得到悬浮的中性粒细胞。将所得肿瘤相关中性 粒细胞裂解，测定蛋白浓度，膜芯片用封闭缓冲液封闭 １ｈ后 加样，４℃过夜振荡孵育，清洗液清洗三次，生物素抗体室温孵育 ２ ｈ，清洗液清洗三次，ＨＲＰ－链霉亲和素室温避光振荡孵育 ２ ｈ，ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００化学发光成像分析系统进行分析。 １．４ 统计学方法