酶工程复习重点

一酶和酶工程概论

1.酶工程:将酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。

2.应用领域:食品工业轻工业医药工业酶的应用:用于治疗疾病用于加工和生产一些产品用于化验和水质监测用于生物工程的其他分支领域

二酶学基础1酶:活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，又称为生物催化剂.

酶的分类:蛋白酶类六大类①氧化还原酶类②转移酶类3水解酶类4裂合酶类5异构酶类6连接酶类

2酶系统分类编号EC 类. 亚类. 小类. 序号

3酶催化作用的特点:高效性,专一性专一性：一定条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。

按专一性程度可分为以下三类：

绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应如脲酶催化尿素的分解反应

4不可逆抑制:抑制剂与酶的活性中心发生了化学反应，或共价地连接到酶分子的必需基团上，阻碍了底物的结合或破坏了酶的催化基团不能用透析或稀释的方法除去抑制剂，酶活性难以恢复。不可逆抑制作用与时间有关

5可逆抑制:抑制剂与酶蛋白以解离平衡为基础，以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失抑制剂可以通过物理方法（如透析等）被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。可逆抑制作用与时间无关.

6抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。

7非竞争性抑制的特点：

⑴非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；

⑵抑制剂与酶的活性中心外的位点结合；

⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响抑制程度取决于抑制剂的浓度

⑷动力学参数：Km值不变，Vm值降低。

8反竞争性抑制的特点：

⑴反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；

⑵抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；

⑶必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加；

抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度

⑷动力学参数：Km减小，Vm降低。

9酶活力是指在一定条件下，酶所催化反应的初速度，它是定量表征酶催化能力的指标

第三章酶的生物合成与发酵生产

1应用微生物来开发酶的优点

1、微生物种类多，酶种丰富；

2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶；

3、微生物培养基来源广泛，价格便宜；

4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程；

5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。

2、酶发酵生产的类型1、液体深层发酵：液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。

2、固体培养发酵培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件下发酵。

3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。

4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。

3酶的生物合成模式可发分为4种类型：

（1）同步合成型（2）延续合成型（3）中期合成型（4）滞后合成型

4选择与改造选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺条件：（1）同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。2）中期合成型要从解除阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力（3）滞后合成型在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。

四酶的分离与纯化1酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度

2酶破碎方法1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎

3、酶的分离方法沉淀分离离心分离过滤与膜分离层析分离电泳分离萃取分离

4亲和层习析原理：专一又可逆亲和力的生物分子对：

酶与底物酶与竞争性抑制剂酶与辅助因子抗原与抗体酶RNA与互补的RNA分子或片段

5固定相：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶及聚丙烯酰胺。流动相：含有欲分离物质的混合液

6根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析分：共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析

7双水相萃取

双水相：高聚物—高聚物聚乙二醇(PEG)／葡聚糖(Dex)；

高聚物——无机盐PEG／磷酸盐PEG／硫酸铵因两相均含有较多的水，所以称之为双水相8超临界流体特点：密度接近液体－－萃取能力强粘度接近气体－－传质性能好

常用萃取剂极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难）非极性萃取剂：二氧化碳（易）

五酶与细胞的固定化技术

1游离酶使用中的局限性1. 稳定性差 2. 提取纯化繁琐,价格昂贵；难以重复使用,成本高3. 产物的分离纯化较困难（酶反应后成为杂质）

2 固定化酶优点1增加了酶的稳定性2能降低酶的总体费用3酶的分离和回收变得容易，并可重复使用4使反应过程的连续操作成为可能5反应产物也易于提取纯化6有利于过程设计和优化7拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等）3固定化酶指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用

4固定化细胞（原生质体）指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力

5酶的固定化技术（一）吸附法

原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等

此外还可利用专一的亲和力来固定细胞

优点: 操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活载体廉价易得，且可反复利用

缺点：结合相当弱酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活每年高浓度盐溶液或底物溶液可加速蛋白质的脱附。当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的

6包埋法概念：将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋法（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种

优点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高

缺点：包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物