不同浓度四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型的比较

孙家昌，孙妩 弋，厉歆然，彭文婷，杜佳佳，魏 伟 （安徽 医科大学临床药理研究所，抗炎免疫 药物教育部重点 实验室，
抗炎免疫药物安徽省协 同创新 中心，合肥 ２３００３２）
［摘 要】 目的 对 比观 察 不 同剂量 四氯化碳 （ｃｃ１ ）诱导 小 鼠肝纤 维化模 型 的效果 ，探 索一种 稳定 可 行且较 为高效的肝纤维化小 鼠造模方法。方法 将 ６Ｏ只 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为正常组和模型 组 ，模 型组 小 鼠分别腹腔 注射 体积 分数 １０％ 的 ＣＣ１４（５ Ｉｎ】 ｇ）以及体 积 分数 ２０％ 的 ＣＣ１４（１ ｍＬ／ｋｇ）， 每周 ２次，连续 ８周。分别在造模 ２周 、４周、６周、８周注射后处死小鼠，进行 ＨＥ染色和 Ｍａｓｓｏｎ 染色，检测血清丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）和天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）水平，以及肝 匀浆氧化 ／抗氧化指标，丙 二 醛（ＭＤＡ）、谷胱甘 肽过 氧化 物酶（ＧＳＨ）和超氧化 物岐化 酶（ＳＯＤ）变化 ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法检 测肝 组 织中胶原表达情况。结果 随着造模 时间的延长，病理染色显示肝纤维化程度不断加重，胶原表达 逐步增加，血清 、ＡＳＴ水平逐渐升 高，肝 匀浆 ＳＯＤ、ＧＳＨ活性降低，氧化产物 ＭＤＡ含量升 高。 在 造模 的相 同时 间点 ，体 积 分数 １０％ ＣＣ１４、５ ｍＬ／ｋｇ剂 量组 相 比 于体 积分 数 ２０％ ＣＣ１４、１ ｍＬ／ｋｇ 剂量组，病理染 色显示肝纤维化程度 更加严重，血清 ＡＬＴ、ＡＳＴ水平明显升高，肝脏 中ＳＯＤ、ＧＳＨ 活性 明显 降低 ，氧化产物 ＭＤＡ含 量 明显 升 高，肝 纤维化 形成 的 时间更短 ，效 果更好 。结论 两种 造 模 方 法都 能形 成肝 纤 维化 小 鼠模 型 ，但体 积 分数 １０％ ＣＣ１４（５ ｍＬ／ｋｇ）￣０量 组 的纤 维化 形成 时 间更 短 且 效 果更好 。因此，每 周 ２次 ，连续 ８周 腹腔 注射 １０％ ＣＣ１４（５ ｍ ｇ）可 作 为一种 较 为理 想 的纤 维化 小 鼠造模 方 法 。 【关 键词］肝 纤维化 ；四 氯化碳 （ＣＣ１４０）；小 鼠；模 型
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对湿 度 ４０％～７０％，明暗循环 １２ ｈ：１２ ｈ［ＳＹＸＫ（皖） ２０１４—００６］，自由饮 食 。６Ｏ只 小 鼠随机分 为 ５ ｍＬ／ｋｇ 体 积分 数 １０％ ＣＣ１ 给 药组 、１ ｍＬ／ｋｇ体积 分数 ２０％ ＣＣ１ 给 药组 和 正常 对照 组 。 １．２ 主要 试剂 与仪 器
１ 材料 与方 法
１．１ 实验 动物 及 分组 选取 ６～８周龄清 洁级 雄性 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小 鼠６０只，
体 质 量（１８± ２）ｇ，由安徽 医 科大 学 实验 动 物 中心 ［ＳＣＸＫ（皖 ）２０１４—００１］提供 。饲 养温 度 １ ８－２２℃，相
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实验动物与比较医学 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
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实验动物与比较 医学 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 源自文库
ｄｏｉ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１６７４—５８１７．２０１８．０４．００３
不 同浓 度 四氯 化碳 诱导 小 鼠 肝 纤 维 化 模 型 的 比较
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［收 稿 日期 】２０１８．０４．０３ 【基 金项 目】国家 自然科 学基金（８１７７０６０５，８１３００３３２）；安徽省
高校优秀青年人才支持计划项 目重 点项 目 （ｇｘｙｑＺＤ２０１８０２４） 【作 者简 介】孙家 ￣（１９９３．），男，硕 士生 ，研究方向：肝脏药 理 学 。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｕｎｊｃ５６７８＠１６３．ｃｏｍ 【通讯作者】孙妩 弋（１９８１．），女，博士，副教授，硕士生导师，研究 方 向：肝 脏 药 理学 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｗｕｙｉ５１＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｒｎ 魏 伟（１９６０一），男，博 士，教授，博 士生导师，研究 方 向：抗炎免疫药理学 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｗｅｉ＠ａｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
［中图分 类号 】Ｑ９５—３３ 【文献标 ｉ，ｑｔｉ￣］Ａ 【文章编 号】１６７４—５８１７（２０１８）０４—０２５５—０６
肝 纤维 化 是各 种 肝 损 伤 持 续 存 在 、 组 织 发 生 修复 反应 时 因细胞外 基质 合成 、 降解与 沉积 不平衡 而 引起 的病 理 过 程 ，如 果 损 伤 因素 长 期 存 在 ，将 增加 发展 为肝硬 化甚 至肝 癌 的可能性 ，对人 类健 康
抗 Ｉ、ＩＩＩ型 胶 原抗 体（美 国 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公 司）； 抗 Ｄ—ａｃｔｉｎ抗 体 （北京 中杉 金桥 生 物技 术有 限公 司）； ＣＣ１ （上海凌峰化 工有 限公司）；玉米油（嘉里粮油有 限 公 司 ）； 丙氨 酸 转 氨 酶 （ＡＬＴ）、天 冬 氨 酸 转 氨 酶 （ＡＳＴ）、丙 二 醛（ＭＤＡ）、超 氧 化物 歧 化酶 （ＳＯＤ）、 谷胱 甘肽过氧 化物 酶（ＧＳＨ）试剂盒 （南京建 成生物 工 程研 究所 ）。多功 能酶标 仪 Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ １０００ ＰＲＯ（瑞 士 Ｔｅｃａｎ公司），正置显 微镜 ＢＸ５３（日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ光 学 株 氏会 社），电泳 仪（美 国 Ｂｉｏ．Ｒａｄ公 司），化 学 发 光 成像 分 析仪 （美 国 ＧＥ公 司）。 １．３ 实验 方法 １．３．１ 模型建立及处理 小鼠适应性饲养 １周，动 物 体征状 态恢 复稳定后 ，用玉米 油分别 配制体积 分 数 １０％ 或体 积分数 ２０％ ＣＣ１ 油溶 液 ，分别腹 腔注 射 体积 分数 １０％ ＣＣ１ 油溶液 （５ ｍＬ／ｋｇ）或体积 分数 ２０％ ＣＣ１４油溶液 （１ ｍＬ／ｋｇ），每 周 ２次 ，连续 ８周 ， 两组对 照组小 鼠分别 腹腔注射 等量 的油溶 液 。分 别 在造 模 ２周 、４周 、６周 、８周 结束 后 ，眼 眶 后静 脉丛 取血 处死 小 鼠 ，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心后 收集 血清 ， 于 一８Ｏ ℃冰 箱 冻存 待 测 。 １．３．２ 肝组织病理学检查 取部分肝脏右叶，用体 积分 数 １０％ 甲醛溶液 固定 ，石 蜡包 埋 ，切片后 ＨＥ 和 Ｍａｓｓｏｎ染色 ， 中性 树脂 封 固后于 显微 镜下 观察 肝 脏 病 理 变 化 。 １．３．３ 血清转氨酶水平的检测 按照试剂盒说明书， 检 测 小 鼠血 清 中的 ＡＬＴ、ＡＳＴ水 平 。 １．３．４ 肝 匀浆的制备 及 ＭＤＡ、ＳＯＤ、ＧＳＨ 的测定 处 死小 鼠后 ，立 即取 出肝脏 ，称 取 ５０ ｍｇ肝组 织 ， 用 预 冷 的生 理 盐 水洗 去 浮 血 ，用 生 理 盐 水研 磨 成 １０％ 的肝 匀浆 ，检测 肝 组织匀 浆 中的 ＭＤＡ、ＧＳＨ、 ＳＯＤ 水 平 ，具 体操 作 步骤 依 照 说 明书 。 １．３．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检 测肝 脏 Ｉ、ＩＩＩ型 胶原 的表 达 提 取 肝组织 总 蛋 白，进行 标准 蛋 白定 量 。上样 后进行 １０％ ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳 ，后 转移 至 ＰＶＤＦ膜 ， 使用质 量分 数 ５％ 的脱 脂奶粉 ３７℃封 闭 ２ ｈ，分 别 孵育 Ｉ、ＩＩＩ型 胶 原 一抗 （１：５００ 稀 释）和 Ｄ—ａｃｔｉｎ 一 抗 （１：１ ０００稀释），４℃过夜后 ，用 ＴＢＳＴ洗
的威 胁较 大 。针对肝 纤维 化发 病机制 以及 药物 治疗 的研究 一直是 近年研 究 的热 点 ，建立稳 定可 靠 的肝 纤 维化模 型是 进行 后续研 究 的前提 ，对 科研 进展 至 关 重要 。近年 来关 于肝 纤维化 小 鼠模 型 建立 的报道 较 少 ， 因此 ，本 研 究 比较 了 不 同 浓 度 四氯 化 碳 （ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＣＣＩ４）诱 导小 鼠肝 纤维 化模 型 的方 法 ， 以期 探 求 更 加 优 化 的造 模 方 式 。