口蹄疫亚洲I型液相阻断ELISA抗体检测试验

口蹄疫亚洲I型液相阻断ELISA抗体检测试验

一、适用范围：

试剂盒来自中国农业科学院兰州兽医研究所，适用于A型和亚洲I型口蹄疫抗体检测。

二、器材准备：

1．移液器：5-50μl移液器、0.2-10μl移液器、50-200μl移液器、50-300μl移液器各一把。

2．抗原抗体反应板：微量血凝板（U型、V型均可）若干块，用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。

3．水质要求：无离子水或蒸馏水均可。

三、试剂准备：

1．包被缓冲液（PH9.6）

将试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开，将胶囊内粉末小心倒入100ml无离子水中溶解即可。4℃存放，1月内有效。

2．洗涤液（PBST）

将本试剂盒配备的25倍浓缩PBST液（可能有结晶形成，用时微热溶化）用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。（如果PH降低，务必用NaOH调制7.4）

3．底物溶液

取1片柠檬酸-磷酸盐片剂（试剂盒配备）溶于100ml无离子水中，溶解后，取50ml 溶液，再加1片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装（5ml/瓶或10ml/瓶），避光-20℃保存。用前避光溶化，临用时每1ml上述溶液加10μl3%的双氧水（H2O2）。务必加双氧水！

四、操作步骤：

1．用包被缓冲液稀释亚洲I型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1:1000）,在ELISA 板上每孔加50μl，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。

2．抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应根据不同的需要，选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。

图1 96孔酶标板检测10份样品布局图

A

B

C

D

E

F

G

H

图1为抗体滴度测定（定量）检测10份样品布局图；图2为抗体滴度测定（定量）检测20份样品布局图。

图2 96孔酶标板检测20份样品布局图

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

以图1为例，在U型血凝板上按50μl/孔量用PBST将待检血清从1:4开始做2倍连续稀释至1:512。同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔加入50μl用PBST稀释到使用浓度的亚洲I型口蹄疫病毒抗原（稀释浓度以试剂盒说明书为准），病毒抗原对照孔加100μl。振荡混匀，封板，4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。

3．用洗涤液（1×PBST）连续洗ELISA板5次，在吸水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔，每孔50μl，封板，37℃温育1小时。

4．同上洗版5次，甩干。用豚鼠兔抗血清稀释液稀释亚洲I型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），每孔加50μl，封板，37℃温育1小时。

5．同上洗版5次，甩干。用1×PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度（1:1000），每孔加50μl，封板，37℃温育1小时。

6．同上洗版5次，每孔加50μl底物溶液（务必加双氧水），37℃温育15分钟。每孔再加50μl终止液终止反应，立即在492nm波长下读取光吸收值（D492nm值）。

五、结果判定

1．试验认可标准

每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照D492nm值应在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1:8。

2．血清抗体效价的判定

抗原对照孔是4孔，弃去最高和最低D492nm OD值，计算剩余2孔的平均D492nm值，再除以2，即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照D492nm值。

3．结果判定

抗体效价大于或等于1:128，判为口蹄疫亚洲I型抗体阳性；1:64～1:128时，判为可疑；小于1:64，判定为阴性。可疑血清样品，可以重测，重测抗体效价大于或等于1:128，判为阳性，小于1:128，判为阴性。

4．ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系

牛、羊：抗体效价≥1:128，99%以上保护；效价≤1:16，不保护；效价在1:22～90间，50%保护。