16SrRNA

关于细菌的16srRNA和16srDNA

分子生物学技术的应用使肠道微生态学的研究取得了突破性的发展。目前研究最多的是16S rRNA。近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细

菌的16SrRNA进行研究，得到了广泛的细菌

16SrRNA序列库。使用该方法可以检测肠道中常规方法不能培养或生长缓慢的细菌。rRNA分子在生物体中普遍存在，生物细胞rRNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列。在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程

相一致的突变率,在结构上可分为保守区(conserveddomain)和可变区(variabledomain), 保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生(phylogenesis)关系。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16SrRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序

列测定和分析比较。16SrDNA是细菌染色体上编码

16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成[62]。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。Woese(1980)在比较200多种原核生物和真核生物的16S(或18S)rRNA/rDNA的核苷酸序列谱后,定义建立了古细菌界(包括产甲烷菌、极端嗜盐菌和极端嗜热菌),将生物界重新划分为3主干6界系统,即古细菌、真细菌和真核生物3个主干,真核生物又包括原生动物、真菌、植物和动物4界。因为古细菌虽然细胞结构和真细菌相似,但在脂类和细胞壁分子结构上

有较大差异,16SrRNA碱基序列分析结果也表明古细

菌与真细菌之间的同源性差异不小于原核和真核生

物之间的差异。现在人们已经认同16SrRNA/rDNA

基因序列可用于评价生物的遗传多态性

(geneticdi-versity)和系统发生关系

（p hylogeneticrelation-ship),在细菌分类学中可作

为一个科学可靠的指标。在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时,由于分离培养技术的限制,难以获得它们

的纯培养进行生理生化学等指标的分析,这样

16SrRNA/rDNA序列分析的优越性就体现出来了。近

来许多研究人员从环境微生态系统中直接分离提取出16SrRNA/rDNA并进行序列分析,研究了包括哺乳动物肠道、沼泽淤泥和反刍动物瘤胃等许多复杂系统的微生物组成情况,并发现了一些传统培养法研究未发现的新种类。

DGGE （Denaturing Gradient Get Electrophoresis, DGGE）技术是由Fischer 和Lerman 于1979 年最先提出的用于检测DNA 突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。1985 年Muzyers 等首次在DGGE 中使用“GC夹板”和异源双链技术,使该技术日臻完善。为了避免建立基因文库的繁杂劳动,Muyzer等(1993)将遗传指纹技术(geneticfingerprinttech-niques)引进了微生物生态学研究中,在经过样品DNA分离和PCR 扩增获得16SrDNA片段后,通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)直接获得

16SrDNA片段组成图谱(即遗传指纹),进而得到待研究体系的微生物组成信息。

细菌的16S rRNA的序列有10个保守区和9个高变区（V1-V9）之分，其中保守区为所有细菌共有，细菌间无差别，能反映生物物种的亲缘

关系，可变区具有属或种的特异性，序列则随菌间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标，利用这一特性设计引物来进行物种鉴定。