实验 硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶
苯丙氨酸解氨酶的测定
苯丙氨酸解氨酶的测定一、实验目的利用无土栽培技术培育不同pH下水芹，使用离心技术粗提取苯丙氨酸解氨酶，用分光光度计测不同的吸光值。
二、实验原理无土栽培是用人工配制的培养液，供给植物矿物营养的需要。
离心技术的应用是将样品放入离心机的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一向外的离心力。
由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。
分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。
三、仪器与试剂仪器：高速离心机、分光光度计、玻璃瓶、研钵、烧杯、量筒、试管、剪刀和纱布等。
试剂：霍格兰营养液，磷酸缓冲液,0.02mol/L苯丙氨酸,硼酸缓冲液，高锰酸钾材料：水芹幼苗，0.1mol/LNaOH溶液四、操作步骤一、水芹的无土栽培1.配好无土栽培营养液，准备7个玻璃瓶，分别加入15ml营养液。
再加NaOH溶液把玻璃瓶中pH值调成5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，贴上标签。
2.把水芹幼苗从玻璃瓶中取出经过洗净，用高锰酸钾消毒处理后，分别移入盛有营养液的玻璃杯中，放在光照培养箱培养3.定期观察并注意加霍格兰营养液和NaOH溶液使玻璃瓶中pH保持不变。
二、水芹中苯丙氨酸解氨酶的粗提取1.等到水芹大概张到20cm左右，就把它们分别从玻璃瓶中取出，在30℃暗中培养5小时。
然后分别把同一pH值的水芹分别剪成根，茎，叶，根茎，根叶，叶茎，根茎叶七个部分均为0.5g。
2.加预冷的pH7.2磷酸缓冲液5mL，冰浴下充分研磨，均匀混合，用4层纱布过滤。
4000rpm 离心15min，弃沉淀。
获上清液用磷酸缓冲液稀释5倍，作为酶测定的粗提液，置于冰浴下保存备用。
三、水芹中苯丙氨酸解氨酶的吸光度测定设计对照试验：A：取粗水芹酶液0.1mL，加入2.5mL 0.02mol/L苯丙氨酸B：取0.1mL硼酸缓冲液，加入2.5mL 0.02mol/L苯丙氨酸（对照）。
苯丙氨酸脱氨酶实验报告
一、实验目的1. 了解苯丙氨酸脱氨酶（Phenylalanine Dehydrogenase，简称PAH）的基本性质和作用。
2. 掌握苯丙氨酸脱氨酶活性的测定方法。
3. 通过实验验证不同条件下苯丙氨酸脱氨酶活性的变化。
二、实验原理苯丙氨酸脱氨酶是一种参与生物体内氨基酸代谢的酶，其活性对于许多生物学过程至关重要。
本实验采用邻苯二胺法测定苯丙氨酸脱氨酶活性。
该方法原理是：苯丙氨酸脱氨酶将苯丙氨酸脱氨后，产生苯丙酮酸，苯丙酮酸在反应中与邻苯二胺反应，生成深蓝色化合物。
该化合物的蓝色深浅与苯丙酮酸的浓度成正比，可以通过分光光度计测量吸光度来测定苯丙酮酸的生成速率，从而计算苯丙氨酸脱氨酶的活性。
三、实验材料1. 实验试剂：苯丙氨酸、邻苯二胺、氢氧化钠、三氯化铁、蒸馏水等。
2. 实验仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管等。
四、实验方法1. 配制苯丙氨酸溶液：称取苯丙氨酸0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1mg/ml的苯丙氨酸溶液。
2. 配制邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1mg/ml的邻苯二胺溶液。
3. 氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠0.5g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成5%的氢氧化钠溶液。
4. 三氯化铁溶液：称取三氯化铁0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1%的三氯化铁溶液。
5. 样品处理：取适量样品，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成一定浓度的样品溶液。
6. 实验步骤：a. 取试管一支，加入苯丙氨酸溶液2ml。
b. 加入样品溶液2ml。
c. 加入邻苯二胺溶液2ml。
d. 加入氢氧化钠溶液2ml。
e. 混匀，置于恒温水浴锅中，在特定温度下反应一定时间。
f. 取出试管，加入三氯化铁溶液1ml。
g. 混匀，用分光光度计在特定波长下测定吸光度。
h. 根据吸光度计算苯丙氨酸脱氨酶活性。
五、实验结果与分析1. 苯丙氨酸脱氨酶活性随温度升高而升高，在50℃时达到峰值，随后随温度升高而降低。
苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程
苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程
1．目的
规范苯丙氨酸脱氨酶试验标准操作规程。
2．原理
某些细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与三氯化铁作用形成绿色化合物。
3．试剂
3.1 苯丙氨酸琼脂成分
DL-苯丙氨酸2g 氯化钠5g
酵母浸膏3g 磷酸氢二钠1g
琼脂12g 蒸馏水1000ml
PH 7.3
3.2 制备除琼脂外其他的成分加热溶解，调PH至7.3，再加入琼脂溶解后分装，每管约4ml,置120℃灭菌15分钟，置成斜面，凝固后冰箱保存，备用。
4．质控
大肠埃希菌ACTT 25922为黄色，阴性；普通变形杆菌CMCC49001为绿色，阳性。
5.操作步骤
将待检菌接种至苯丙氨酸琼脂斜面，35℃孵育18～24小时，在生长的菌苔上滴加三氯化铁试剂，即刻观察结果。
6.结果判断
斜面呈绿色者为阳性。
7.注意事项
7.1 注意接种菌量要多，否则出现假阴性反应。
7.2 苯丙氨酸脱氨酶试验需在加入三氯化铁试剂后，立即观察，因为绿色易很快褪去，不管阳性或阴性结果，都必须在5分钟内作出判断。
8.临床意义
本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
变形杆菌、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性，肠杆菌科其他细菌则为阴性。
硫酸铵分级沉淀原理及实验方案
一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定
粗提
硫酸铵沉淀
凝胶层析
离子交换层析
注：（ 1 ）绘制蛋白质测定的标准曲线：以 1~ 5 号管溶液的 A 59 5 值为纵 坐标，相应管中的蛋自质微克数为横坐标，作图。
(2) PAL 比活力计算：
六、注意事项 1. 往酶液中加固体硫酸铵时，注意不能有大颗粒，加的速度也不能过快。 2. 层析柱要保持与地面垂直，往柱内加样品时要小心，避免冲坏床面。 七、思考事项
上样：让胶床表面几乎不留液层，将 l ml 酶液小心注入胶床而中央，注意不要 冲坏床面，吸取 lm ！磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在 床表面仅有 lml 左右液层时，再小心地用滴管加入 5 - 6 cm 高的磷酸缓冲液 洗脱。
洗脱收集：取刻度试管 5 支（包括上面一支），编号，柱床上面不断加磷酸盐 缓冲液洗脱，出水口不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集 3m1 。
紫外分光光度计预热 lOmin, 于波长 290nm 处测定各管的 A 290 。
(8) 蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）
取酶液 0.I ml ，用蒸馏水稀释至 5ml.
取试管 8 支，按下表加入各溶液：
试管编号 标准蛋白质溶液 ( ml ) 稀释酶液（ mI ）
0 1 2 3 4 5 67 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
材料：供试植物材料
四、操作步骤
（ 1 ）酶液提取 植物材料 lg ，剪成小段，加入 5 倍体积的酶提取液，于冰 浴上研钵研磨。
(2) 将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管， 10000g 冷冻离心 30 分钟。
(3) 取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，放置冰浴中备用。
（ 4 ）硫酸铵分级沉淀酶蛋白
1. 在 PAL 活力测定中，设置 0 号管和对照管的目的是什么？
生物化学实习报告
生物化学实验报告生物化学综合实验摘要：本次实验包括苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定和大米粉中营养成分的测定两个实验。
关键词：苯丙氨酸解氨酶、Sephadex G—25层析、DEAE纤维素层析、活力、比活力、大米粉、凯式定氮法、索式提取法、3，5—二硝基水杨酸比色法。
实验一苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定一、实验目的1.学习掌握分离纯化生物大分子的方法；2.学习掌握酶活性的测定方法；3.了解在分离纯化过程中酶活性的变化；4.了解高速冷冻离心机及蛋白质检测仪的操作步骤。
二、实验原理苯丙氨酸解氨酶（L—phenylalanine: ammonia lyase,简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关，在植物生长发育和抵制病菌侵害过程中起重要作用。
PAL催化L—苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。
规定1h 内增加0.01为PAL的一个活力单位。
酶的比活力是指样品中每毫克蛋白质所含的酶活力单位数。
在实验中将会看到随着PAL的逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。
在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析。
溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称100%饱和度。
沉淀一种酶所需的具体浓度需要经实验确定。
Sephadex(交联葡萄糖凝胶)是有细菌葡聚糖长连，用交联剂1—氯2—，3—环氯丙烷交联而成。
凝胶商品名后面的G值表示每克干胶吸水量（毫升数）的10倍。
交联度大，网孔小；交联度小，网孔大。
交联度的大小还与凝胶颗粒的机械强度有关，交联度大，机械强度也大（硬胶），在柱层析中流速快。
根据需要，选用一定型号的的凝胶柱做柱层析介质（蛋白脱盐一般用G—25或G—50，G—100~G—200分离不同分子质量的蛋白组分）。
由于被分离物质的分子大小和形状不同，分子质量大的进入凝胶网孔中被阻滞，从而后流出层析住，达到分离的目的。
硫酸铵梯度沉淀蛋白质的方法和原理
硫酸铵梯度沉淀蛋白质的方法和原理蛋白质是生物体的重要组成部分，对于分子生物学的研究具有重要的意义。
硫酸铵梯度沉淀是分离纯化蛋白质的常用方法之一，其原理是利用硫酸铵的溶解度随浓度的变化而变化的特性，将混合物中的蛋白质沉淀分离出来。
本文将详细介绍硫酸铵梯度沉淀蛋白质的方法和原理，以及其在蛋白质纯化中的应用。
关键词：硫酸铵梯度沉淀，蛋白质，溶解度，纯化一、引言蛋白质是生物体内最为重要的基础组成部分之一，不仅具有结构和功能的重要性，还参与了生物体内的各种代谢过程。
因此，对蛋白质的研究一直是分子生物学研究的重要领域之一。
蛋白质的分离纯化是蛋白质研究的前提和基础，其中硫酸铵梯度沉淀是常用的蛋白质分离纯化方法之一。
二、硫酸铵梯度沉淀的方法硫酸铵梯度沉淀是利用硫酸铵的溶解度随浓度变化而变化的特点，将混合物中的蛋白质沉淀分离出来。
具体方法如下：1. 制备不同浓度的硫酸铵溶液，通常可分为以下几个浓度梯度：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。
在实验中，可以根据需要选择不同的浓度梯度。
2. 将待处理的混合物加入到硫酸铵梯度中，然后进行离心。
3. 离心后，可以观察到蛋白质在不同浓度梯度中的沉淀情况。
通常来说，蛋白质会在一定的硫酸铵浓度范围内沉淀下来，而在其他浓度范围内则会溶解。
4. 将沉淀的蛋白质收集起来，可以进行进一步的纯化和分析。
三、硫酸铵梯度沉淀的原理硫酸铵梯度沉淀的原理是利用硫酸铵的溶解度随浓度变化而变化的特性。
在水中，硫酸铵的溶解度随着浓度的增加而增加，但是在一定浓度范围内，硫酸铵的溶解度会达到最大值，超过这个浓度范围后硫酸铵的溶解度又会逐渐降低。
因此，在硫酸铵梯度中，待处理的混合物中的蛋白质会在一定浓度范围内沉淀下来，而在其他浓度范围内则会溶解。
四、硫酸铵梯度沉淀在蛋白质纯化中的应用硫酸铵梯度沉淀是蛋白质纯化中常用的方法之一，其优点是操作简便，效果明显，能够得到较高的纯度。
硫酸铵分级沉淀蛋白质流程
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硫酸铵梯度沉淀蛋白质的方法和原理
硫酸铵梯度沉淀蛋白质的方法和原
理
硫酸铵梯度沉淀技术是一种快速、简单且可靠的分离蛋白质的方法。
该方法使用硫酸铵溶液的不同浓度梯度，使不同大小、不同溶解度的蛋白质沉淀在不同稠度的硫酸铵浓度上。
硫酸铵梯度沉淀的原理是根据蛋白质的稳定状态的变化和它与水的相互作用，利用孔径分布大的聚合物悬浮在浓硫酸铵溶液中，然后逐渐降低硫酸铵浓度，在不同的溶剂强度下逐步沉淀。
硫酸铵梯度沉淀法通常分为三个步骤：制备硫酸铵梯度溶液、样品预处理和梯度沉淀。
第一步是制备硫酸铵梯度溶液。
通常使用一系列硫酸铵溶液来形成梯度。
较重的硫酸铵在底部，较轻的溶液在上部。
常用8组硫酸铵梯度在10%-70%的浓度范围内。
硫酸铵的最终浓度应根据所需的最佳分离结果进行确定。
第二步是样品预处理。
在开始分离之前，需要处理样品以去除任何干扰物质。
这包括滤除杂质、去除非蛋白质成分和调整pH值。
样品预处理的步骤将有助于提高分离效率和纯度。
第三步是梯度沉淀。
具体方法是将预处理后的样品按照顺序依次加入硫酸铵梯度溶液的顶部。
在离心过程中，蛋白质会根据浓度梯度沉淀在不同的硫酸铵溶液中。
效果最佳的浓度范围，可以根据不同的样品类型和实验目的来确定。
硫酸铵梯度沉淀的优点是可分离多种种不同分子量的蛋白，同时产生高度纯化的蛋白。
但需要注意的是，萃取温度、pH、搅拌时间的变化等操作因素可能会影响效果，需要较高的操作技巧，适合于有一定操作经验或者从事分子生物学、生物化学相关研究的人员。
同时，该方法不适用于一些特殊的蛋白。
硫酸铵分级沉淀原理及实验方案
一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% — 50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 ° C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′ g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心30 min （4 ° C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 ° C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
(完整版)硫酸铵分级沉淀原理及实验方案
一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
紫外照射诱导采后番茄苯丙氨酸解氨酶的分离纯化
重要的理论 意义 和现实 意义 。为今后 进行该 酶 的结构
与功能分析及酶基因克隆等研究奠定基础 。
１ 材 料和 方法
１１ 试验材料与试剂 ．
１ １１ 材料 ．． 于 ２０ 年 ４ １ ０６ 月 ９日采摘北 京通洲“ 加州
表现 出较好的效果ｌ ， 人对 ＵＶ Ｃ诱 导抗病 性机 理 ２ 前 ］ －
２ ｍ）上 海锦 华层 析设 备厂 ）Ｂ Ｚ １０电脑全 自动部 ０ｃ （ 、 Ｓ 一０
分收集器 、 －Ｉ ＨＤ Ｉ紫外检 测仪 、 Ｄ Ａ 电脑采 集器 、 一 Ｉ Ｈ — ＨＬ ２ 恒流泵均为上海青浦沪西仪器厂 。电泳 仪 ： Ｙ 一Ｃ型， Ｄ Ｙ８
电泳槽 ： Ｙ Ｚ２ Ｄ型（ Ｄ Ｃ －４ 北京市六一仪器厂） 。
多， 生物及非生 物 因子 （ 微生 物 、 如 化学 物质 、 理 因素 物 以及天 然 物质 等）都 能 够 诱 导 果 蔬 产 品采 后 的 抗 病 性Ｅ ， 中低剂量短波紫外线（ ｌａｉ ｅ Ｃ ， ＿ ） ｌ其 ？ ｕ ｒ ｏ ｔ ｕｖｃ 照射 ｔ ｖ ｌ— 在诱导 多种采 后果 蔬抗 病性 、 延缓 成熟 、 制腐 烂方 面 控
阳光” 番茄 ， 选八成熟 、 无病虫 害 、 无机械损 伤 、 大小均匀 的果实进行试 验。 １ ０为 Ｆｕ ａ 一５ 一５ ｌｋ 分 装 、 Ｅ Ｄ纤维素为 Ｗｈ ｔ ｎ分装 、 聚糖凝胶 Ｇ ２ 为 ＤＡ ａｍａ 葡 －５ Ｐ ａｍ ｄ 分装 、 乙烯 吡咯烷 酮为 Ｓｇ ａ分装 、一 ｈｒ ａ ａ 聚 ｉ ｍ Ｉ巯基 ３ 乙醇为 Ｇ ｎｉ ｅ ｖ ｗ分装 、 ｅ 四甲基 乙二胺 为 Ａｌ ｉ ｄｃ ｒ ｈ分装 ， 其 余为 国产分析级试剂或生化试剂 。 １ １３ 试 验 设 备 ．． 柱 层 析 装 置 包 括 层 析 柱 （ ｍ× １ｃ
绿豆苯丙氨酸解氨酶的分离提纯及抗肿瘤的初步研究
绿豆苯丙氨酸解氨酶的分离提纯及抗肿瘤的初步研究
牛三勇;杜欣
【期刊名称】《兰州医学院学报》
【年(卷),期】1992(018)003
【摘要】采用丙酮沉淀,硫酸铵分段沉淀,超滤,DEAE-一纤维素柱层析。
L-苯丙氨酸—琼脂糖4B亲和层析等方法,从绿豆芽中分离纯化苯丙氨酸解氨酶(PAL),纯化326倍,产率为9.6％。
纯化的PAL经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检验为单一的蛋白质区带。
亚基分子量为72000道尔顿。
绿豆的PAL有一定程度的耐热性。
最适pH8.7,对酸碱波动耐受性强。
经DEAE-纤维素柱层析从绿豆中分出二种PAL,其Km值分别为9.4×10^(-5)(PALl),6.2×10^(-5)(PAL2) 绿豆PAL对L1210小鼠淋巴细胞白血病细胞株的体外抑制实验,初步确定PAL对此瘤株的生长具有抑制作用。
【总页数】4页(P148-151)
【作者】牛三勇;杜欣
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
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4.绿豆苯丙氨酸解氨酶的提纯及固相化研究 [J], 马克颖;姚侃
5.苯丙氨酸解氨酶诱导人白血病HL-60细胞凋亡的初步研究 [J], 王晓华;张东方;郑珺
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苯丙氨酸解氨酶与其在重要次生代谢产物调控中的作用研究进展
特征，而未经分离的同工酶混合物却表现为典型的负 协同变构酶动力学特征[14]。 各种来源的 PAL Km 不同，
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中国农学通报 第 24 卷 第 12 期 2008 年 12 月
氨酸解氨酶与其在重要次生代谢产物 调控中的作用研究进展
张宽朝 ， 金 青 ， 蔡永萍 ， 林 毅
(安徽农业大学生命科学学院， 安徽合肥 230036)
摘 要 ： 苯丙 氨 酸 解 氨酶 （phenylanlanine ammonialyase ，PAL，E.C.4.3.1.5 ） 作 为 植 物 次 生 代 谢 特 别 是 苯丙 烷途径 的 关 键 酶 ， 具 有 重 要 的 生 理 意 义 。 综 述 了 PAL 的 存 在 与 分 布 、 分 离纯 化 、 酶 学 性 质 、 三维 结 构 和 作 用 机 制 ， 并分 析了 苯丙 氨 酸 解 氨酶 与植 物 重 要次 生 代 谢 产 物 生 产 的 关 系 ， 以期进一 步 丰 富 次 生 代 谢 产 物 的 调 控理 论 ， 为 PAL 在 次 生 代 谢 产 物 生 产 中 发 挥 作 用提 供 基 础 数据 。 关 键词 ： 苯丙 氨 酸 解 氨酶 ； 苯丙烷途径 ； 次 生 代 谢 产 物 中 图分类 号 ：Q814 文 献标识码 ：A
+ 4
为 10-4~10-2 mmol/L 之间， 且有的存在两个 Km。 4 PAL 的三 维 结 构 M Jason MacDonald 等总结了 Calabrese 等测定的 Rhodosporidium toruloides PAL 的 三 维 结 构 [10]。 Rho－ dosporidium toruloides PAL 是 1 个 每 个 亚 单 元 包 含 716 个残基的同源四聚体， 亚基分子量为 76.88KDa， 每 形成 “海马” 状， 所以 个亚基与两个别的亚基头尾相连， 增大了邻近亚基的相互作用， 产生了 1 个四聚物。 四聚 物 组 装 形 成 一 个 4 个 连 位 巯 基 丙 氨 酸 （残 基 140， 455， 467 和 530 ） 的簇团。 PAL 的主体结构与 HAL 具相似的折叠， 有 1.4A 的均方根偏差。PAL 的长度可 变的近于平行的 α- 螺旋有 1 个中央核心区。PAL 最 长的螺旋含有 61 个 残 基 （505~565 ） ， 几 乎 跨 越 了单 体 的整个长度。只有 1 个 β- 折叠的断面长于 3 个残基
短波紫外线诱导采后番茄苯丙氨酸解氨酶的分离纯化
文章编 号 ：１７ — ６ ６（ ０ ６ ０ — ０ ７ ０ ６ ９４ ２ ０ ） ８ ０ ６ — ４ １
短波紫外 线诱导 采后 番茄苯 丙氨酸解氨酶 的分 离纯化
孙 旭 东 ， 荣瑞 芬
（ 北京联合大学 师范学 院，北京 １０ １ ） ００ １ 摘要 ：以番茄为试材 ，经 ２４ｋ／ ｚ ． Ｊｍ 短波紫外线 （ Ｖ Ｃ ｕ — ）照射 ，取果皮 经冰浴研磨 、硫酸铵分级沉淀 、凝胶 过滤 和离
收 稿 日期 ：２０ － ８ ０ ０６０ —３
苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 （ｈｎｌａｉｅａ ｏｉ—ｖｇ， ｐ ｅｙａ ｎｎ ｍｍ ｎａｌａｅ ｌ
ＰＬ Ａ ）是植物次生物质代谢系统中的一种关键酶 。许 多研究表明，植物品种 自身的抗病性与苯丙氨酸代谢 途径有密切关系。植物受病原菌侵染后 ， 抗病品种的 Ｐ Ｌ活性 比感病 品种 提高 的 幅度大 ，并 能迅 速合 成与 Ａ 抗 病有 关 的生化 物质 ，如 生物 碱 、植物保 卫 素 、木质 素等 ，有效地阻止了病原菌的扩展 ，Ｐ Ｌ Ａ 活性可作为 植物 抗病 性 的生 化指 标【。 因此 ，本研 究 以 番茄 为试 ｌ ２ ］ 材 ，对 ｕ — Ｖ Ｃ照射 采后 番茄 果 皮 Ｐ Ｌ进 行分 离 纯化 ， Ａ 并 进行 活 性 分 析 测 定 ，从 而 了解 Ｐ Ｌ在 ｕ — Ａ ｖ Ｃ控 制 病害中的作用以及对植物采后诱导抗痴Ｉ机理与 Ｐ Ｌ 生 Ａ 的作用 ，为今后进行该酶的结构与功能分析及酶基因 克隆等研究奠定基础。
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第 ８ 总第 ７ 期） 期（ ３
２０ ０６年 ８月
农产品加工 ・ 学刊
Ａ ａｅ ｉ ｅｉ ｉ ｌ ｆ ａ Ｐｏｕｔ ｒｃｓｉｇ ｃｄ ｍ ｃＰｒ ｄｃ ｒ ｒｄ ｃｓＰｏｅｓ ｏ ａ ｏ Ｆ ｍ ｎ
沉淀分离蛋白实验报告
一、实验目的1. 了解沉淀分离蛋白的基本原理和方法。
2. 掌握使用硫酸铵沉淀法进行蛋白质分离的操作技能。
3. 熟悉蛋白质纯化的基本过程。
二、实验原理蛋白质在不同盐浓度下具有不同的溶解度，当盐浓度达到一定值时，蛋白质的溶解度会降低，从而从溶液中沉淀出来。
硫酸铵沉淀法是利用蛋白质在硫酸铵溶液中的溶解度随盐浓度增加而降低的特性，通过调节硫酸铵浓度使蛋白质沉淀，进而实现蛋白质的分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：蛋白质样品、硫酸铵、PBS缓冲液、蒸馏水、离心机、移液器、烧杯、试管、滴管等。
2. 实验仪器：分析天平、磁力搅拌器、pH计、紫外分光光度计等。
四、实验步骤1. 准备蛋白质样品：将蛋白质样品用PBS缓冲液溶解，浓度控制在1-10mg/mL之间。
2. 加入硫酸铵：向蛋白质溶液中缓慢加入硫酸铵溶液，使最终硫酸铵浓度为0.5mol/L。
3. 混匀：用磁力搅拌器搅拌混匀，使蛋白质充分沉淀。
4. 冷藏：将混合物放入4℃冰箱中冷藏数小时，使蛋白质充分沉淀。
5. 离心：将混合物以3000r/min离心15min，分离蛋白质沉淀和上清液。
6. 收集沉淀：将沉淀取出，用蒸馏水洗涤沉淀，去除上清液中的杂质。
7. 干燥：将洗涤后的沉淀在通风、干燥的条件下干燥，可用氮气吹干或放置在干燥器中。
8. 纯度鉴定：用紫外分光光度计检测蛋白质的纯度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质沉淀：通过加入硫酸铵，蛋白质在溶液中逐渐形成沉淀，说明硫酸铵沉淀法可以有效分离蛋白质。
2. 沉淀纯度：经离心和洗涤后，沉淀纯度较高，说明沉淀分离法可以去除杂质，提高蛋白质纯度。
3. 蛋白质含量：经紫外分光光度计检测，蛋白质含量符合预期，说明实验操作成功。
六、实验结论1. 硫酸铵沉淀法是一种有效的蛋白质分离方法，可以用于蛋白质的纯化。
2. 通过调节硫酸铵浓度和离心条件，可以实现对蛋白质的分离和纯化。
3. 实验操作过程中，注意控制实验条件，以确保实验结果的准确性。
鲜切山药中苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及酶学性质研究
鲜切山药中苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及酶学性质研究唐正弦;曹敏捷【摘要】[目的]研究铁棍山药中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的动力学特性.[方法]以铁棍山药为研究对象,探讨铁棍山药切片后苯丙氨酸解氨酶的动力学特性,并考察底物浓度、pH、温度与酶浓度对酶活性的影响,筛选最优条件.[结果]PAL最适底物浓度为1 mmol/L,底物浓度过高或过低都对酶活力不利.PAL在硼酸-氢氧化钠缓冲液中适宜的pH范围为7.6～9.2;最适pH有2个,分别为pH 8.0和pH8.8.PAL适宜的温度范围为35～55℃,最适反应温度为45℃,超过70℃则容易钝化.经硫酸铵分级沉淀、透析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析,纯化出苯丙氨酸解氨酶(PAL),蛋白回收率为0.36％,酶回收率为3.1％,纯化倍数为3.76.[结论]该研究为解决市场新鲜山药易褐变的问题及提高山药的贮藏性提供了有效依据.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)027【总页数】3页(P10928-10930)【关键词】铁棍山药;苯丙氨酸解氨酶;特性;抑制剂【作者】唐正弦;曹敏捷【作者单位】广州市凯虹香精香料有限公司,广东广州510550;广州市凯虹香精香料有限公司,广东广州510550【正文语种】中文【中图分类】S632.1苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL)能催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，为多种酚类及类黄酮终产物提供前体［1］，与酚的生成有关，因而与褐变关系密切。
该酶存在于所有绿色植物中，在真菌，细菌，藻类中也有发现，主要有霉菌与酵母菌［2］。
自Koukol和Conn首次从植物中发现PAL至今，该酶已在多种植物中分离纯化并得到深入研究［3］。
铁棍山药为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)植物，富含淀粉、粘液质、糖蛋白、胆碱、维生素C和甘露骤糖等，还含有谷氨酸、酪氨酸、丙氨酸等18种氨基酸，以及铁、钙、锌、磷、锰、钴、铜等10余种微量元素［4］，倍受当代消费群体的亲睐。
苯丙氨酸的脱氨酶法测定
苯丙氨酸的脱氨酶法测定
范长胜;胡宝龙;杨仁根
【期刊名称】《氨基酸和生物资源》
【年(卷),期】1995(17)3
【摘要】方法的原理是：由某些微生物所产生的苯丙氨酸脱氨酶能使苯丙氨酸分子氧化脱氨，生成相应的苯丙酮酸。
在合适的反应体系中，苯丙酮酸与三氯化铁反应生成的化合物呈蓝绿色，这种颜色的深浅与苯丙氨酸含量成正比，制备的标准曲线有良好的线性。
【总页数】3页(P33-35)
【关键词】苯丙氨酸;氨基酸;脱氨酶法;分析
【作者】范长胜;胡宝龙;杨仁根
【作者单位】复旦大学微生物学系
【正文语种】中文
【中图分类】Q517.03
【相关文献】
1.固定化苯丙氨酸脱氨酶拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸 [J], 房月芹;朱龙宝;黄楠;周丽;丁重阳;刘颖;周哲敏
2.人工合成苯丙氨酸脱氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达 [J], 贾兴元;陈星;苏畅;吕月平;高斌;肖白;刘敬忠
3.苯丙氨酸脱氨酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究 [J], 吴晓燕;郭丽芸;戚晓红
4.Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶活性的影响 [J], 郭军玲;张帆;黄楠;周丽;周哲敏
5.鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造 [J], 黄楠;朱龙宝;周丽;周哲敏
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管 试号
剂
0
1
1'
2
2'
3
3’
PH8.7 0.1mol/L 硼酸缓
冲液（ml）
4.0
3.9 4.9 3.9
4.9
3.9
4.9
酶粗提取液(ml)
/
0.1
0.1
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/
/
/
稀释沉淀液[1](ml)
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/
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0.1
0.1
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/
稀释沉淀液[2]（ml）
/
/
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/
/
0.1
0.1
0.6mmol/L L-Phe(ml) 1.0
分级沉淀：
✓ 不同盐浓度下各种蛋白质的溶解度是不同的， 因此调节溶液的盐浓度可使各种蛋白质先后 沉淀出来，或者使需要的酶与其它杂质蛋白 分开，达到提纯目的，这就是分级沉淀法。
✓ 硫酸铵沉淀一般在蛋白纯化的步骤中前期用， 它简便且重复性好，但纯化倍数不高。分级 沉淀中需加的固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液 的量，可从硫酸铵饱和度量表中查得。
1.0
/
1.0
/
1.0
/
实验步骤
3.酶活力测定：
（4）以上试管放入恒温水浴（40℃）中保温 60 min后，立即加入0.2ml 6N HCl，混匀，终 止反应； （5）于波长290 nm处，以0号管溶液调零，分 别记录测得的各管A290值。
酶活单位定义：规定1小时内A290增加0.01为 PAL的一个活力单位。
实验步骤
3.酶活力测定：
（1）将沉淀[1]和沉淀[2]分别溶于1ml酶抽提 液中，待沉淀全部溶解后，量出其体积V2、 V3，记为沉淀液[1]和[2]； （2）分别从沉淀液[1]和[2]中吸出0.2ml加入 另外二个试管内，然后用酶提取液分别将其 稀释成1ml，记为稀释沉淀液[1]和[2]；
（3）取试管7支，按下列编号并加入各试剂：
实验（一）硫酸铵分级沉淀分离苯丙 氨酸解氨酶（8学时）
一、实验背景
了解硫酸铵沉淀蛋白质的原理；掌 握分级沉淀分离酶的基本操作和方法
二、实验原理
盐析：
✓ 在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如 硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为 盐析，因为中性盐在水中解离时，能夺走蛋 白质胶粒表面的水分子，破坏水膜结构；同 时中性盐解离后形成的带电离子能中和蛋白 质表面的电荷，这两种作用使溶液中蛋白质 沉淀析出。
✓ 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 （ L-pheቤተ መጻሕፍቲ ባይዱylalanine:ammonia lyase，简称PAL）是植物体内苯丙烷类代谢的 关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异 黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关， 在植物的正常生长发育和抵御病菌侵害的过程 中起重要作用。
✓ PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨， 产物反式肉桂酸在波长290nm处有最大吸收值。 在反应系统中如果酶的加入量适当，反式肉桂 酸的生成速率即A290升高的速率可在几小时内 保持不变，因此，可通过测定A290 升高的速率 来测定PAL的活力。规定1小时内A290增加0.01 为PAL的一个活力单位。
四、实验步骤
1、 酶液提取：
（1）取小麦幼苗（发芽5~6天）2克，用剪 刀剪成小段后，立即放入有10 ml酶提取液 的研钵中，于冰浴上研磨匀浆，匀浆结束前， 再加入10ml酶提取液研磨混匀 （2）将已匀浆的酶液，用三层纱布过滤、挤 干。滤液转入离心管，平衡后，于10,000 g 下冷冻离心30min； （3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出 其体积V1，放置冰浴中备用。
三、实验试剂
0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（PH8.7） 酶提取液—0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（内含
1mmol/L EDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）。取 100ml 0.1mol/L 硼酸-硼砂缓冲液（PH8.7）,加 入0.037克EDTA钠盐，混匀，临用前再加入 0.137mlβ-巯基乙醇，混匀； 0.6mmol/L L-Phe溶液。 称取L-Phe 9.912毫克溶于100ml蒸馏水中； 6N HCl溶液 固体（NH4）2SO4
实验步骤
2. 硫酸铵分级沉淀酶蛋白：
（3）将上述溶液到入离心管，3,000g下冷冻 离心30min，倒上清液于烧杯内，保留沉淀， 记为沉淀1； （4）根据硫酸铵饱和度用量表中，查出从 40%到75%饱和度所需硫酸铵用量，算出并 称取实际应加的硫酸铵量； （5）按上述（2）、（3）步同法处理，离心 后，倒出上清液，保留沉淀，记为沉淀2。
五、结果计算
1、PAL总活力计算：
分别算出每ml酶粗提液和沉淀液[1]和[2] 中PAL的总活力；
2、算出40~75%硫酸铵沉淀中PAL 的回收率：
回收率=
沉淀液[2]中PAL总活力 酶粗提液中 PAL总活力
╳100（%）
下面开始实验！
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实验步骤
2. 硫酸铵分级沉淀酶蛋白： （1）从酶粗提液中吸取出0.5 ml，以作后面
活力测定等用，根据实际体积和硫酸铵饱和 度用量表，算出达到40%饱和度实际应加入 酶液中的硫酸铵量，并称取该量的硫酸铵；
（2）将酶液到入烧杯内，烧杯置于冰浴中， 然后在边缓慢搅拌下缓慢加入称好的固体 硫酸铵（不能有大颗粒，放在研钵中研 碎），待全部硫酸铵加入后，再缓慢搅拌 20min；