掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术原理
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法The manuscript was revised on the evening of 2021蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。
本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。
-------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一我是超级蜘蛛精看我有劲儿不？冲啊，我是美国队而我是一只冷静的科研小蜗牛这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。
硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。
蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。
每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。
硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。
各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。
在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。
（1）参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH到。
生物化学实验 实验五 血清IgG粗品的制备
一、目的：
掌握盐析法分离蛋白质的基本操作。
二、原理：
蛋白质的分离纯化是一项十分重要的实验技术。 盐析法是经典的蛋白质沉淀分离方法之一，其原 理是利用中性盐类能破坏蛋白分子表面的水膜， 从而使蛋白质凝聚，并从溶液中沉淀析出。沉淀 不同蛋白质所需盐类的浓度不同。例如，50%饱 和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33%饱 和的硫酸则使γ-球蛋白沉淀。因此，可根据所要 分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进 行盐析。用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某 种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来 表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定 为100％。盐析某种蛋白质组分所需硫酸铵数量 折算成100％饱和度的百分之几，即称为该蛋白 盐析的饱和度。
沉淀用0.4 ml PBS溶解，再滴加饱和硫酸 铵溶液0.4 ml, 冰上静置10 min，使之充分 盐析，以5000 r/min离心5 min，去掉上 清液，沉淀为IgG粗品，加0.5 ml PBS。20℃保存备用。
五、结果及பைடு நூலகம்析
1、盐析沉淀蛋白变性了吗？可以重新溶解 吗？
2、样品为什么放在冰上？
磷酸盐缓冲溶液(Phosphate-buffered saline, PBS)：NaH2PO4-H2O 0.256 g、Na2HPO4-7H2O 2.248 g、NaCl 8.76 g，加蒸馏水至1000 ml，pH7.3。
四、步骤：
取血清0.4 ml，滴加饱和硫酸铵0.4 ml，注 意边加边混合，以防止硫酸铵局部过饱和。 混合时不要过于剧烈，以免导致蛋白质变性。 冰上静置10 min，使之充分盐析，以5000 r/min离心5 min，去掉上清液，沉淀为IgG 及杂蛋白。
硫酸铵分级沉淀原理及实验方案
一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术原理
材料用具
鲜牛奶
醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液其配制如下： ①配A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称NaAc· H2O 5.44g 溶至200ml。 ②配B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优级纯醋酸2.4g溶 至200ml。 ③取A液约17.7ml，B液约12.3ml混合，用酸度计调得 pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液30ml。
（三）pH
有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定 的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低 的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析 的分辨能力。但应注意的是有少数生物分子在 等电点附近不稳定，影响其活性；同时尽量避 免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的 发生。
（四）离子强度
在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小， 物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决。 盐的浓度太大(0.1～0.2mol／L以上)，就需大量 的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有 机溶剂后析出。同时盐的离子强度达一定程度 时，还会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解 度。所以一般离子强度在0.05或稍低为好，既 能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定 的保护作用，防止变性。
操作方法
等 电 点 沉 析 制 备 酪 蛋 白
5、在沉淀中加入20ml乙醇，搅拌片刻。 将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。 用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用 乙醚洗沉淀2次，抽干。 6、将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋 白纯品。 7、准确称量，计算含量和收率。 含量=酪蛋白g/100mL牛乳
有机溶剂沉析的应用
（一）有机溶剂沉析的特点
优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只 在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱 盐，过滤比较容易。 缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 操作需在低温下进行。
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析之袁州冬雪创作还能想起那些在荧屏中曾震撼过我们，具有超才能的英雄么？蜘蛛侠，火速，矫捷迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿伟人浩克，力气，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物布景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即即是相同的实验步调，每一个人做出来的成果也不尽相同，不同在哪？反复操练，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超才能”吧.本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步调，供大家参考.-------锻炼属于我们自己的实验“超才能”之一我是超等蜘蛛精看我有劲儿不？冲啊，我是美国队长而我是一只岑寂的科研小蜗牛这次，我们所要分享的即是一种很罕见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧.硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常常使用的纯化和稀释蛋白的技术.蛋白质的溶解度和盐浓度紧密亲密相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的连系蛋白概况的水分子，破坏蛋白概况的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下堆积形成沉淀.每种蛋白质的溶解度分歧，因此可以用分歧浓度的盐溶液来沉淀分歧的蛋白质.硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会连系大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，别的，其温度系数小，不容易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采取层析技术进一步纯化蛋白，效率更高.硫酸铵沉淀法是常常使用的分离免疫球蛋白的方法.各种分歧蛋白质盐析需要分歧浓度的硫酸铵溶液.在实验中建议配置分歧梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度.（1）参照如下表格配置分歧浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH到7.0.（2）沉淀蛋白将样品离心，去除沉淀，保存上清液并丈量体积；一边搅拌一边渐渐的加入硫酸铵.接着，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 h，或者4 ℃，搅拌过夜，使蛋白质充分沉淀.加入硫酸铵有两种方式，一种是直接加入硫酸铵固体，在操纵上速度缓慢，不容易太快，否则会造成蛋白变性；另外一种方式是加入饱和的硫酸铵液体，但若需要较高浓度的硫酸铵溶液，需要加入较大体积的饱和硫酸铵溶液，在后续实验操纵中，因蛋白质上清液和硫酸铵饱和溶液的体积之和过大，离心机无法离心，因此根据需要加入的硫酸铵饱和溶液的体积选择合适的方法.别的，每种蛋白质沉淀所需要的硫酸铵溶液的浓度也分歧，因此在每次实验中应该做好观察记录，积累经历值.分享来自网上的一种简单的方法来估计蛋白沉淀所需要的硫酸铵溶液的浓度范围，供大家参考：将蛋白质溶液分成5份，每份分别加入硫酸铵至浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%，离心，弃蛋白质沉淀，留取上清，再向上清液中加入硫酸铵，使得浓度从原先的20%升高到30%，30%的浓度升到40%，40%的浓度升为50%.......，离心保存沉淀，分析沉淀中是否含有目标蛋白，以此确定沉淀目标蛋白所需要的最佳硫酸铵溶液的浓度.（3）透析除去硫酸铵将蛋白质溶液离心沉淀，弃上清保存沉淀.加入10-20 ml的PBS-叠氮化钠溶液溶解蛋白质，叠氮化钠不于蛋白质反应，但能防止蛋白质变性.蛋白沉淀溶解之后，放入透析袋中透析24-48 h，每隔5 h 更换透析液除去硫酸铵.收集透析液，离心，测定上清中蛋白质的含量.友情提示：成长中的实验达人：从未犯错的人，从未试图创新.--------爱因斯坦所以做好详细的实验步调，实验成果的分析，不竭测验测验，不竭总结吧.。
硫酸铵盐析
硫酸铵盐析1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。
2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。
3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。
4.盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。
3.5为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。
5.盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50 处理。
6.一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。
盐析法①原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。
其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。
这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。
但盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。
盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。
②盐的选择：蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱和溶解度为4.1mol/L,即767g/L;0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，不容易引起蛋白质变性。
应用硫酸铵时，对蛋白氮的测定有干扰，缓冲能力比较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以上溶解度太低。
硫酸铵沉淀原理
硫酸铵沉淀原理
硫酸铵沉淀法的基本原理:这是一种从大量粗制品中提取并部分提纯蛋白质的方法。
主要是通过将免疫球蛋白从试样中分离，通常采用的方法是：高浓度的盐离子蛋白溶液和蛋白质的水分子发生竞争，导致其水和蛋白质分子减弱，通过溶解度从溶液沉淀出来。
因不同的蛋白质溶解度相同，所以用相同的盐溶液进行沉淀，称为盐析。
盐的含量一般用饱和度来表示，而硫酸铵由于具有较高的溶解度，较低的温度系数，容易引起蛋白的变性，因此得到广泛的应用。
硫酸铵分级沉淀的原理【硫酸铵分级沉淀原理及实验方案】
硫酸铵分级沉淀的原理【硫酸铵分级沉淀原理及实验方案】一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
乳酸盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从氢氧化钠中沉淀出来。
各种脂肪酸的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来氢氧化钾沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使弯果而应用最为广范。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清成品或腹水等2. 硫酸铵（ NH 4 ） SO 43. 饱和硫酸铵溶液（ SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养选种上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边蒸馏边慢慢加到 1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸吴萸到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 ° C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的酿制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.烘烤边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为1 ： 1 （4.将溶液磁力放在磁力搅拌器上所搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 °C ），使大分子充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心 30 min （4 ° C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
实验四 血清IgG的分离制备—盐析法
实验四 血清IgG 的分离制备—盐析法实验类型：验证型目的和要求掌握盐析法的原理及操作。
原理IgG 是免疫球蛋白（Immunoglobulin ，简称IgG ）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s 。
IgG 是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG ，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG 。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in ）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out ）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster 首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L 的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L ，即767g/L ，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L ，即676g/L 。
固液分离和硫酸铵分级沉淀纯化藻蓝蛋白
固液分离和硫酸铵分级沉淀纯化藻蓝蛋白一、目的1掌握提取液的固液分离方法。
2掌握硫酸铵分级沉淀藻蓝蛋白的原理和方法。
3熟练硫酸铵分级沉淀蛋白技术。
二、原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将提取液中的藻蓝蛋白和杂蛋白分离。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中一方面可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，另外可以中和蛋白质表面所带电荷，降低蛋白质之间的静电排斥，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
采用硫酸铵分级沉淀可以分别沉淀杂蛋白和藻蓝蛋白，实现藻蓝蛋白的纯化。
三、实验器材及试剂1实验仪器及工具：机械搅拌器、冰箱、电子天平、酸度计、漏斗、离心机、三角瓶、烧杯、移液枪等。
2实验原料及试剂硫酸铵、稀酸、稀碱等。
四、实验方法及步骤1、样品准备：打开低温离心机预冷30分钟，将藻蓝蛋白提取液分装至50毫升离心管中，每管装液量约为30～40毫升，不能超过40毫升，每管都要用天平进行称重平衡。
2、固液分离：将平衡好的离心管对称放置，装样品不能对称时，可以用离心管装水对称，盖好盖子后开始离心，离心过程中必须有专人看管，离心结束后必须等到转速降为0才能打开离心机。
3、藻蓝蛋白提取液体积量取：用量筒量取上清液体积并记录，然后将藻蓝蛋白提取液分为设定份数，记录体积（留取1份放至冰箱冷藏）。
4、硫酸铵分级沉淀：根据藻蓝蛋白提取计算出10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%饱和度所需的硫酸铵，分别加入到上述藻蓝蛋白溶液中，机械搅拌均匀后放在4℃静置过夜分级沉淀。
5、沉淀蛋白量测定：将沉淀蛋白固液分离后称取湿重，记录湿重。
五、实验结果记录藻蓝蛋白提取液体积记录藻蓝蛋白溶液颜色观察、记录沉淀蛋白颜色记录沉淀上清液颜色记录六、实验结果分析。
(完整版)硫酸铵分级沉淀原理及实验方案
一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最为广范。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（NH 4 ）SO 43. 饱和硫酸铵溶液（SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含0.2g /L 叠氮钠)6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33% —50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS ）1.将767g （NH 4 ）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25 °C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水）20 000 ′g 离心30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS 到上清液中，终浓度为1 ：1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或搅拌过夜（4 °C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液10 000 ′g 离心30 min （4 °C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml ）PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS -0.2g /L 叠氮钠透析24-48 小时（4 °C ），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。
本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。
-------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一我是超级蜘蛛精看我有劲儿不？冲啊，我是美国队长而我是一只冷静的科研小蜗牛这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。
硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。
蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。
每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。
硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。
各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。
在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。
（1）参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH 到7.0。
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法教学内容
蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。
本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。
-------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一我是超级蜘蛛精看我有劲儿不？冲啊，我是美国队长而我是一只冷静的科研小蜗牛这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。
硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。
蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。
每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。
硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。
各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。
在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。
（1）参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液；例如，在25 ℃条件下，配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液，称取767 g的硫酸铵固体，边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸调节pH 到7.0。
硫酸铵盐析法沉淀蛋白质
硫酸铵盐析法沉淀蛋白质硫酸铵盐析法是一种常用的蛋白质分离和富集方法。
下面是关于这种方法的相关参考内容。
硫酸铵盐析法是一种重要的蛋白质分离和纯化方法，可以根据蛋白质在不同硫酸铵饱和度下的溶解度差异来实现目标蛋白质的分离和富集。
该方法不仅简单易行，而且能够得到相对纯度较高的蛋白质制备样品。
硫酸铵盐析法在生物化学、分子生物学和生物制药等领域得到了广泛应用。
硫酸铵盐析法的步骤主要包括以下几个方面：1. 配制硫酸铵溶液：精确称量所需分析纯硫酸铵，加入适量的去离子水，搅拌溶解，制备成不同浓度的硫酸铵溶液，通常可以利用浓度梯度来进行控制。
2. 样品溶解：将目标蛋白质样品用适量的缓冲液溶解，以达到适宜的溶解浓度。
3. 硫酸铵盐析：将步骤2中的蛋白质样品滴加至已配制好的硫酸铵溶液中，滴加时需充分混匀，待溶液静置后观察，并进行适当的调整，使得蛋白质快速沉淀。
常见的硫酸铵饱和度为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%。
4. 沉淀收集：将形成的蛋白质沉淀用离心机进行离心分离，收集上清液和沉淀，并用冷盐溶液或冷酸淋洗沉淀，以去除残存的盐类和杂质。
5. 蛋白质重悬：将沉淀用适量的缓冲液重悬，使其再溶解。
6. 蛋白质纯化：可以根据需要选择适当的纯化方法对蛋白质进行进一步纯化，如色谱层析、电泳分离等。
除了硫酸铵盐析法，还有一些其他常见的蛋白质分离和富集方法，包括酒精沉淀法、酸沉淀法、离子交换层析和亲和层析等。
这些方法在不同的研究领域和实验目的下都有其适用性和局限性。
综上所述，硫酸铵盐析法是一种简单易行、高效可靠的蛋白质分离和富集方法。
通过控制不同硫酸铵饱和度下的溶解度差异，可以实现目标蛋白质的纯化和富集。
这种方法在生物化学、分子生物学和生物制药等领域得到了广泛应用，为蛋白质研究提供了重要的技术支持。
参考文献：1. Bommarius AS, Blum JK, Abrahamson MJ, et al. "Effects of ammonium sulfate on the heat activation of Bacillus caldovelox glutamate dehydrogenase." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Protein Structure and Molecular Enzymology. 1990, 1039(1): 45-50.2. Hu Z, Hong P, Domigan L, et al. "Optimization of condition for the isolation of canola proteins by ammonium sulfate precipitation." J. Food Process. Preserv. 1997, 21(4): 335-348.3. Laemmli UK. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature. 1970,227(5259): 680-685.4. Pierce Biochemicals. Protein Precipitation with Ammonium Sulfate, Technical Bulletin. Pierce Biochemicals, 2020.。
下游技术实验讲义分析
下游技术实验讲义分析【实验一】薄层层析分析果汁糖成分√【目的要求】学习、掌握薄层层析分离的基本操作技术。
【实验原理】薄层层析是一种微量而快速的层析方法。
最早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化铝薄层分离了植物提取液。
层析是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。
为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。
硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂，在吸附刘或支持剂中添加了适合的粘合剂再涂布，可使薄层粘牢在玻璃板（或涤纶片基）这类基底上。
硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12%-13%的石膏（CaSO4）,它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层使不同的物质得以分离。
例如糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖>己糖>双糖>三糖。
若用硼酸溶液市制硅胶G可改进分离效果。
对己分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法各组分的含糖量。
薄层层析一般采用上行法，在具有密闭盖子的玻璃缸中进行，溶剂倒于缸底，简单地将薄板放入即可。
保证层析缸内有饱和的蒸气是实验成功的关键。
保证措施是在层析缸内壁衬一层浸湿溶剂的滤纸或缩小层析缸的容积。
因为层析时，溶剂会从薄层上蒸发，样品移动到一定距离的时间就会处长。
若所用溶剂系统由几个成分组成，挥发性较大的成分首先蒸发，就会使混合溶剂的组分改变，而溶剂的蒸发从薄板的中央向两边递减，致使溶剂前沿呈弯曲状，结果往往是使两边的R f值大于中央位置的R f值。
薄层层析与其它方法比有明显的优点：层析时间短，可以分离多种化合物，用样品量少（微克级），与纸层析相比要灵敏10-100倍，观察结果方便，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。
盐析的操作方法
③盐析的操作方法：最常用的是固体硫酸铵加入法。
欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。
盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。
在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。
各种饱和度需加入固体硫酸铵的量可由附录中查出。
硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线性体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，有人经过精心测量，确定出1L纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。
④盐析曲线的制作：如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。
具体操作方法如下：取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。
继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，查出相应的硫酸铵饱和度。
将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH值缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。
以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。
⑤盐析的影响因素(1)蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。
通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。
血浆IgG的分离_纯化及鉴定实验报告
血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告一、实验目的掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。
二、实验原理1.血浆IgG是免疫球蛋白（简称Ig）的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。
要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。
2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。
而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。
这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。
3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。
盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。
即称为该蛋白质盐析的饱和度。
4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：在蛋白质要求达到50%以下时采用：V＝V0*（C2－C1）/（1－C2）V0－－蛋白质溶液的原始体积C1－－所要达到硫酸铵饱和度C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度三、试剂与仪器饱和硫酸铵溶液，0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液四、实验步骤1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，混合。
向其中加入2.5ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%（加入过滴加边搅拌），加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白）2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。
【法律】盐析法流程
盐析法流程1️⃣ 盐析法基本原理盐析法，作为一种经典的化学分离技术，其核心在于利用不同物质在盐溶液中的溶解度差异，通过向溶液中加入适量的无机盐（如硫酸铵、氯化钠等），降低目标溶质（如蛋白质、酶、核酸等生物大分子）在水中的溶解度，从而实现目标溶质与溶剂或杂质的有效分离。
这一过程基于溶质分子与溶剂分子间相互作用力的变化，特别是盐离子的屏蔽效应，减少了溶质分子与水分子间的氢键作用，促使溶质析出。
2️⃣ 盐析法操作流程步骤一：溶液准备首先，需将待分离的混合物溶解于适量的水中，形成均匀的溶液。
对于生物大分子的提取，常需考虑溶液的pH值、离子强度等因素，以维持目标分子的天然构象，避免变性。
步骤二：盐类选择与添加根据目标溶质的性质及溶解度曲线，选择合适的无机盐进行添加。
通常，硫酸铵因其溶解度随温度变化小、成本低廉且对多数生物分子具有较好的盐析效果而被广泛应用。
盐的添加量需经过实验优化，以达到最佳分离效果。
步骤三：盐析与沉淀随着盐的逐渐加入，溶液中目标溶质的溶解度逐渐降低，直至达到饱和状态，形成可见的沉淀。
此过程需缓慢搅拌，避免局部浓度过高导致的不均匀沉淀。
步骤四：沉淀收集与洗涤通过离心、过滤等方法收集沉淀，并用适量的低盐溶液或无盐溶液进行洗涤，以去除附着在沉淀表面的盐分及杂质，提高纯度。
步骤五：溶解与后续处理将洗涤后的沉淀重新溶解于适当的溶剂中，进行进一步的纯化、浓缩或分析。
对于蛋白质等生物大分子，可能还需进行透析、超滤等步骤以彻底去除盐分。
3️⃣ 盐析法的应用与优势盐析法因其操作简便、成本低廉、对生物分子活性影响小等优点，在生物化学、制药、食品工业等领域有着广泛的应用。
它不仅可用于蛋白质的初步纯化，还可用于病毒、核酸等生物大分子的提取与分离。
此外，盐析法还具有较好的环境友好性，相比有机溶剂萃取等方法，对环境的污染较小。
综上所述，盐析法作为一种经典的化学分离技术，通过精确控制盐的种类、浓度及操作条件，实现了对复杂混合物中目标溶质的高效分离与提纯，为科学研究与工业生产提供了有力的技术支持。
饱和硫酸铵溶液盐析蛋白质原理
饱和硫酸铵溶液盐析蛋白质原理
向鸡蛋清中加入饱和硫酸铵溶液，可以观察到的现象为析出沉淀，说明饱和硫酸铵溶液可使蛋白质的溶解性变小（填“变大”或“变小”），此过程叫做蛋白质的“盐析”为物理变化．蛋白质受热或遇到浓硝酸、重金属盐、甲醛等化学物质，会发生化学变化，失去原有的生理功能，此过程叫做蛋白质的“变性”．因此，重金属盐、甲醛能使人中毒，若少量的重金属盐中毒，可以吞服蛋白质来解毒．蛋白质烧焦后有烧焦羽毛的气味，这个性质可以用来鉴别蛋白质，例如，如何区分蚕丝和棉纱线？将蚕丝和棉纱线分别点燃，有烧焦羽毛气味的是蚕丝，另一种是棉纱线．
考点：鉴别淀粉、葡萄糖的方法与蛋白质的性质；亚硝酸钠、甲醛等化学品的性质与人体健康．
专题：课本知识同类信息．
分析：只有熟悉蛋白质的性质、影响蛋白质活性的因素、重金属盐中毒的解救和蛋白质的鉴别方法，才能正确解答本题．
解答：解：根据课本知识可知：
向鸡蛋清中加入饱和硫酸铵溶液，可以观察到的现象为析出沉淀，说明饱和硫酸铵溶液可使蛋白质的溶解性变小，此过程叫做蛋白质的“盐析”为物理变化．
蛋白质受热或遇到浓硝酸、重金属盐、甲醛等化学物质，会发生化学变化，失去原有的生理功能，此过程叫做蛋白质的“变性”．因此，重金属盐、甲醛能使人中毒，若少量的重金属盐中毒，可以吞服蛋白质来解毒．蛋白质烧焦后有烧焦羽毛的气味，这个性质可以用来鉴别蛋白质，区分蚕丝和棉纱线的方法如下：将蚕丝和棉纱线分别点燃，有烧焦羽毛气味的是蚕丝，另一种是棉纱线．
故答案为：析出沉淀；变小；物理；热；浓硝酸；重金属盐；甲烷；化学；蛋白质；烧焦羽毛；将蚕丝和棉纱线分别点燃，有烧焦羽毛气味的是蚕丝，另一种是棉纱线．
点评：本题主要考查蛋白质的性质、影响蛋白质活性的因素、重金属盐中毒的解救和蛋白质的鉴别方法，难度较小．。
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影响有机溶剂沉析的因素
（一）温度 大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机 溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性， 且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机 溶剂必须预先冷至较低温度，一般在0℃以下，操 作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢， 并不断搅拌以免局部浓度过浓。温度越低，得到 的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的 挥发。
（二）盐析的主要应用
盐析是最早使用的生化分离技术之一，由于易产 生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段 完全能达到很好的分离效果。由于成本低，操作安 全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用， 常用于蛋白质、酶、多肽、多糖、核酸等物质的分 离纯化。
二、有机溶剂沉析
原理
（一）亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了 自由水的浓度，使溶质分子周围的水化层变薄， 导致脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质 的溶解度。 （二）有机溶剂的介电常数比水小，加入有机 溶剂后，整个溶液的介电常数降低，带电的溶 质分子之间库仑引力增强，使溶质分子相互吸 引而聚集。
第四章 沉淀分离技术
• 盐析 • 有机溶剂沉析
• 等电点沉析 • 有机聚合物沉析 • 其他沉析技术
一、盐析 原理
• 溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表 面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子 表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互 作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度 达到一定的限度时，生物分子之间的排斥力降到很 小，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶 解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。 • 产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合 作用降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化 膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用， 使其沉淀析出。
2、加盐的方法
（1）直接加入固体硫酸铵法
（2）加入饱和硫酸铵溶液法
3、盐析操作注意事项 （1）盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸 铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固液分离。 （2）经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进 行第二次盐析要靠试验确定。 （3）盐析操作时加入盐的纯度、加量、加入 方法、搅拌的速度、温度及pH等参数应严格控 制。
（四） pH值 在盐析时，如果要沉析某一成分，应将溶 液的pH值调整到该成分的等电点，如果希望 某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶液 的pH值偏离该成分的等电点。 （五）温度 多数物质的溶解度会受温度变化的影响。
盐析的操作与应用
（一）盐析的操作
1、盐的处理 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产 时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使 用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去 （如通入H2S后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。
有机溶剂沉析的应用
（一）有机溶剂沉析的特点
优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只 在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱 盐，过滤比较容易。 缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 操作需在低温下进行。
（二）应用
有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖 和核酸等生物大分子的沉析分离。使用时先要 选择合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、 温度、pH和离子强度，使之达到最佳的分离效 果。沉析所得的固体样品，如果不是立即溶解 进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉析物， 减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透 析袋透析脱除有机溶剂，以免影响样品的生物 活性
（五）金属离子
在用有机溶剂沉析生物高分子时还应注意到某 些金属离子的助沉作用，一些金属离子如Zn2+、 Ca2+等可与某些呈阴离子状态的生物高分子形 成复合物。这种复合物的溶解度大大降低而不 影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机 溶剂的耗量，0.005～0.02mol／L的Zn2+可使有 机溶剂用量减少l／3至1／2,使用时要避免会与 这些金属离子形成难溶盐的阴离子(如磷酸根) 的存在。
影响盐析的因素
（一）盐离子浓度 在低盐浓度时，盐离子能增加生物分子 表面电荷，使生物分子水合作用增强，具 有促进溶解的作用，称盐溶现象。当盐浓 度达一定值后,盐浓度升高，生物分子溶解 度不断降低,产生了盐析作用,不同的生物分 子，“盐溶”与“盐析”的分界值不同。
（二）生物分子种类 生物分子的分子结构不同，其分子表面亲水基 团与疏水基团不相同，不同生物分子产生盐析现 象所需中性盐的浓度（离子强度）亦不同。 （三）生物分子浓度 溶液中生物分子的浓度对盐析的效果有很大的 影响，要得到理想的沉析效果，必须将生物分子 的浓度控制在一定的范围内。一般对于蛋白质溶 液，其浓度为2%～3%比较合适。
（二）生物样品的浓度
与盐析相似，样品浓度低时增加有机溶剂投入量 和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性， 但共沉的作用小，有利于提高分离效果。反之， 对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少 了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降。 一般认为，对于蛋白质溶液0.5%～2%起始浓度 较合适,对于粘多糖以1%～2%为起始浓度为宜。
（三）pH
有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定 的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低 的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析 的分辨能力。但应注意的是有少数生物分子在 等电点附近不稳定，影响其活性；同时尽量避 免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的 发生。
（四）离子强度
在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小， 物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决。 盐的浓度太大(0.1～0.2mol／L以上)，就需大量 的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有 机溶剂后析出。同时盐的离子强度达一定程度 时，还会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解 度。所以一般离子强度在0.05或稍低为好，既 能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定 的保护作用，防止变性。
（4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共 沉及稀释后收率、盐量和固-液分离等问题。一般 低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常 用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使 蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速率和较长 的离心时间。 （5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、 凝胶过滤及超滤等。