β葡萄糖苷酶的研究进展

Ｂ．葡萄槠苷酶作为纤维豢酶的
部分在Ⅸ疗
个晕要组成
食品生物质转化中有重要的应用
价值特别是随着近年束环境能源等危机的加重， 木质纤维素作为自然界垃』ｌ泛的碳源受到各国政府 的高度蕺视。０葡萄糖背键的水解是纤维索彻底
降解为单糖的一个瓶颈。采用基因工程与蛋白质工 程手段获得优良的Ｂ．葡萄糖苷酶已经成为研究热 点。国外许多研究机构正致力于Ｂ．葡萄糖苷酶的 分子生物学研究。从基础领域研究酶的催化机制及 表达调控机制，以期望更好改善纤维素酶的催化效 率。随着表达系统的发展与完善，Ｂ．葡萄糖菅酶 已经在大肠杆菌和酵母中得到高效表达。近年来在 芽胞杆菌、丝状真菌以及植物中都有Ｂ．葡萄糖苷 酶重组表达的报道。 国内近年来研究Ｂ．葡萄糖苷酶已经成为热点， 已由过去的研究Ｂ．葡萄糖苷酶的简单提取到现在 的酶的培养条件优化以及粗酶液的纯化。Ｂ．葡萄 糖苷酶基因的克隆表达已经得到实现，新构建的工 程菌已经应用到生产实践。
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｘｌｒｅｍｅ
ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ｃｏｌｉ：ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
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【７】Ｈａｋｕｌｉｎｅｎ
ｏｆ
Ｂ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ｓｐ．Ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｆｒｏｍ ｌｏｎｇ
２
￡ａ）、出芽短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、汉逊德 巴利酵母（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉＯ、木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ－
ｍａ
ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、青霉（Ｐｅｎｉｎｃｉｌｌｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｏｇｆｉｓｅｕｍ）、
０一
黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
氧原干的氧键距离内水解反应的基奉过程足第 一酶的亲核集团在第二个梭基侧链提供醢，碱催 化（提供个质子）的帮助Ｆ，击攻击底物的糖仵 键氧原于＂与Ｈ连接形成酶一底物的过渡态；第 一酸／馘集团催化一个术分于攻击酶一底物过渡 态与之反应“切断糖苷键释放一个日一单槠产物 和酶。目前对酶催化糖苷键水解的机理ｒ解的还小 是很清楚．普遍认为酶有两个催化活性中心：一个 是亲桉中心．井一个为酸般催化中心。在糖基化作 用下．酶的亲桉－｛ｔ心攻击底物异史碳原于，形成Ⅱ 佝像的糖基酶共价中间体，然后由水舟导酶底物中 间体水解（酶的男一活性中心供持．１｛，糖苷键水 解）。１３．错基产物形成．酶回复到其＂蛤的质子状 态。通过动力学标１０、序列分析、对特殊的氯基瞎 进行化掌修饰点突变等方法来研究酶的催化底物 水解的分于机制对于酶的活性中心的砦氨基醴 强基的特殊作用已取得ｒ进展。酸性氧基醢带冉
１２７
作用ｐ一（１，１），Ｂ－（１，２），ｐ一（１，３），Ｂ・ （１。６）键，具有转移葡萄糖基的作用。在水果、蔬 菜中除了游离的挥发性风味物质外，还有大量的以 Ｂ．葡萄糖苷的形式存在的非挥发性风味前体物质， Ｏ．葡萄糖苷酶能够释放这种香气的前体物质，因 此，开发了Ｂ．葡萄糖苷酶作为水果风味增香酶的 应用领域。目前，国内对黑曲霉中Ｂ．葡萄糖苷酶 研究较多．但由于采用黑曲霉作为产酶菌株存在食 品安全卫生方面的隐患．所以在食品加工中的应用 受到限制。目前有研究选用德氏乳杆菌亚种进行 Ｂ．葡萄糖苷酶的分离和纯化，并应用于大豆异黄 酮的水解过程中，制备大豆异黄酮苷元。通过该菌 株生产的Ｂ．葡萄糖苷酶具有高安全性的特点，为 Ｂ一葡萄糖苷酶的应用和开发提供更广阔的空间。
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【６】６ Ｆｕｋｕｄａ
！！些些堡兰！塑！苎苎堡！！
．ＣＯＯＨ基Ⅲ在Ｂ，葡萄糖苷酶的催化过稚巾起若非
懑爹
目１卜自自％＃《＊十ｇ目
常重譬的作ＪＨ．酶的亲植催化中■和酸碱催化中心 都含有酸性氨基酸Ａｓｐ和Ｇｌｕ。家族１中的０一葡 萄糖苷酶属于“７超家旗成员，在其Ｂ－折叠结构 中的Ｃ端第４位和第７位都是Ｇｌｕ残基。在家族３ 的成员中，则发现“即为保守氩基酸６ 成法 目前普遍认为存在两种反应娄刊
Ｐａｒｒｙ Ｊ，Ｄａｖｉｄ Ｅ，ｅｔ
ａ
ａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ
Ｂ一葡萄糖苷酶的应用及前景展望 Ｂ．葡萄糖苷酶除作用Ｂ．（１，４）键外，还能
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ
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ｔｅｎｓｉｖｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ａ
Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ
ｅｘ－
ｂｅｔａ—ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ
的显大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和芽孢杆菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）丧选系统。蓖组表达的酶话量Ⅱｒ达野生 株的几十倍乃莹上日倍…。 ６国内外研究现状
…ｈａｎｉｓｍ）。催化反应需婴２十重要氯基醢残雎：
质子供体（Ｐｒｏｔｏｎ ｄｏｎｏｒ）和亲核集团（Ｎｕｃｌｅ
ｏ口ｈｉｌｅ）．
般是带般基侧链的氨基酶位于糖苷键的
１
ｐ一葡萄
水解压麻
精苷酬近年来艘应用于合成生物寡特以代替化学合 Ｉ｝同源区、ｃ 的逆反应和转牿廿反，ｔ．戈十水解反应机制和转糖 苷键反应机制如罔２所示，
的Ｍ域构成Ｎ端【ｚ、Ｎ端催化区 端未知功能Ｋ
如表ｌ所币 Ｃ端残摹＂】．
泉自水解酶家旌３的１３，葡萄糖什酶亲核中心
＆１＃＊￥＊《ｉ《３∞镕Ⅻ｛＃＃目
篡熹＝嚣嚣焉黑一
ｐｅｌｔａ－
Ｄ一葡萄糖苷酶的酶族分类 根据氨基酸序列分类，人们将Ｂ．葡萄糖苷酶
划分在糖苷水解酶家族ｌ和３中。家族ｌ中的１３． 葡萄糖苷酶来源于细菌、植物；家族３中的酶来自 真菌、细菌和植物。家族ｌ中的酶除有葡萄糖苷酶 活性外。还有很强的半乳糖苷酶活性【ｌ】。 根据高级结构的相似性，糖苷酶家族可以被分 成若干部族（Ｃｌａｎ）。糖苷水解酶家族ｌ属于‘ｃｌａｎ ＧＨ．Ａ’（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ４／７）．其特点是催化结构域具有 （Ｂ／ａ）桶状结构，２个羧基氨基酸参与催化反应， 作为质子供体和亲核基团。分别位于第４位和第７ 位的１３折叠上ｔ２１。Ｍｏｒａｃｃｉ等通过比较１１种糖苷族 ｌ的酶氨基酸序列发现．Ｎ．Ｅ．Ｐ．和．Ｙ．Ｉ．Ｅ．Ｎ．两个保 守序列．并用定点突变的方法证明保守序列中的两 个Ｇｌｕ分别是酸键集团和亲核集团。也有试验通过 自杀底物共价修饰和定点突变试验证明这种结论【３】。
１３一葡萄糖苷酶的研究进展
孟宪文宋小红陈历俊刘长江北京三元食品股份有限公司
摘要：本文综述了Ｂ一葡萄搪苷酶的酶族分类、分布、理化性质、及其水解糖苷机制，以及国内外对Ｂ一葡萄糖苷酶 分子生物学研究情况。 关键词：Ｂ一葡萄糖苷酶；理化性质；功能
Ｂ．葡萄糖苷酶（１３．Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２１） 属于纤维素酶类．是能催化水解芳香基或烃基与糖 基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶。其来源不 同。底物特异性也不同。
Ｂ＿葡萄糖苷酶的理化性质 １３．葡萄糖苷酶有胞内酶和胞外酶之分．有些
ｔｙｚａｅ）、干酪乳杆菌（１ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）等。现在 对真菌中Ｂ．葡萄糖苷酶产生菌研究较多的是丝状 真菌，主要为曲霉属和木霉属。而细菌中研究较多 的是芽孢杆菌属。
４
生物体内只含有胞内Ｂ．葡萄糖苷酶，也有只含胞 外Ｂ．葡萄糖苷酶，但是有少部分微生物体内同时 含有胞内和胞外Ｂ一葡萄糖苷酶。ｐ，葡萄糖苷酶的 相对分子量一般在４０～２５０ＫＤ之间。不同来源的 Ｂ．葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不 同而差异很大。大部分ｐ．葡萄糖苷酶的最适ｐＨ值 都在酸性范围，并且变化不大，但最适ｐＨ值可以 超过７．０，而且酸碱耐受性强。Ｂ．葡萄糖苷酶的最 适温度在３０－－．１１０℃之间都有分布，～般来说．来 自细菌的ｐ．葡萄糖苷酶其稳定性和最适温度要高
１３－葡萄糖苷酶的结构与功能 通过Ｘ射线晶体衍生法分析出的Ｂ．葡萄糖苷
酶三维空间结构如图１所示。 糖苷水解酶家族ｌ的典型结构具有８个 （ａ／１３）结构围成的桶状结构，也被称为４／７超家 族。糖苷水解酶家族３有Ａ区和Ｂ区两个域构成， Ｂ区包括ＳＤＷ序列，内有活性位点Ａｓｐ残基。在 分子水平上，水解酶家族３的编码基因由５个典型
Ｋ，Ｍ嘶Ｈ，Ｏｋｕｙａｍａ
Ｂ—Ｄ－ｇｌwk.baidu.comｃｏｓｉｄａｓｅ
Ｍ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓ・ ａｆｆｉｎｉｆｉｅｓ ｉｎ
ｓｅｎｔｉａｉ Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ Ｇｏｏｕｐｓ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｕｂｓｉｔｅ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｆ１ ｆｒｏｍ
７
ｄｏｎ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｃｍ，１９９１（２９３）：
７８ｌ～７８８
【２】２
Ｊｅｎｋｉｎｓ Ｊ，ＬｅｇｇｉｏＬＬ，Ｈａｒｉｓ Ａ
ａ
Ｇ，ｅｔ
ａ１．ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，
ｐ—ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ｆａｍｉｌｙ
ｂａｒｌｅｙ ｇｌｙｃａｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ
１
于普通微生物来源的Ｂ．葡萄糖苷酶。对于工业应 用来说。酶的热稳定性越高越有利。对来自嗜热性 和非嗜热性Ｂ一葡萄糖苷酶的分析认为，两者在相 互演化过程中的酶修饰作用并不改变酶的活性中心， 也不改变其专一性。只是将酶蛋白结构作部分调整 以适应高温环境【４】。 ３产Ｂ一葡萄糖苷酶的分布 目前已经发现的产Ｂ．葡萄糖苷酶的生物类群 包括原核生物、真核生物。Ｂ．葡萄糖苷酶普遍存 在于植物、微生物和哺乳动物的肠道中。植物中很 多来源的ｐ一葡萄糖苷酶被纯化和研究，这些来源 有植物的种子、果实、叶苗、根和花。微生物有约 氏黄杆菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎａｅ）、多粘性芽孢杆 菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｒｎｙｘａ）、肠膜明串珠菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、镰刀菌 （Ｆｕｓａｒ／ｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｎｕｍ）、假丝酵母菌（Ｃａｎｄｉｄａ
经研究认为１３．｜自｝ｆ萄糖苷酶的催化机制是 保蛹型的酸催化积置换机制（ｄｏｕｂｌｅ
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Ｂ葡萄糖苷酶的分子生物学研究
术的应川
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Ｏ．葡萄糖甘酶蕈闪方面的研究已经有较长时 间的历史到月前为止．口经有上百个微牛物的 Ｂ．箭萄糖仟酶基崩得到范隆。早期的Ｂ一葡萄糖苷 酶基时的兜隆足通过构建ＤＮＡ空库进行恬性筛选 的方式获得的。随着基州Ｔ程技术的盘雕，ＰＣＲ技 利ＨＪ种属相似性扩增克隆得到许多日 葡萄糖许酶。到目前为止，乳酸荫属（１扯ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ） 就有１１种之害＝随着基因】程学的发展，越米越多 的微乍物基罔纽全序列被测定。利用ｌｑ源序列筛查 定位分析Ⅲ可能的１３葡萄糖苷酶，是获得１３－葡 萄糖膏酶新蕈州的有效手段， 近年来对０葡萄糖苷酶的高教表达普遍采川
ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ，ｆａｍｉｌｙ
Ｆ ｘｙｌａｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｗｏ
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ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ
８－ｆｏｌｄ
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（２１／１３ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ
ｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉａａｉｌ
ａｎｄ ｗｉｔｈ ｏｆ
ｔｗｏ
ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｌｕｔａｍａｔｅｓ
ｎｅａｒ ｔｈｅ