从环境中分离产淀粉酶的菌株

从环境中分离产淀粉酶的菌株

一．【实验目的】

1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。

2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点 并分析不同条件下酶的特性。

4. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。

二．【实验原理】

淀粉酶广泛在于动植物和微生物中是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

三．【实验试剂和仪器】

淀粉培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、氯化钠 0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉0. 8% 。

盛9ml无菌水的试管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶,制霉菌素母液（抑制真菌）。

高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、无菌涂布器、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管等。

四．【实验流程】

倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或倾注法）→培养→挑单菌落→保存。

五．【实验步骤】

①倒平板

将淀粉培养基加热溶化待冷至55～60℃时，混合均匀后分别倒平板，淀粉培养基倒六皿三皿用于稀释平板；三皿用于划线分离。

②制备土壤稀释液

选好采样地点，产去表层5cm，取5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。

称取土样lg，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置80℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持20min（制悬液时就应先开始加热），制成10-1 g/ml的土壤悬液。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。

③涂布

将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在淀粉平板培养基表面中央位置。

用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。

④培养

平板倒置于37℃培养箱中培养24h。取出培养好的平皿, 在长出的菌落上滴加碘液,菌落周围如有无色透明圈出现, 说明淀粉被水解,即该菌株能产生淀粉酶.

⑤画线分离

从稀释平板法所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。将划线分离后的培养皿放入37 ℃培养箱中培养 24 h ，在长出的菌落上滴加碘液,观察记录结果。

⑥富集培养

在上一步划线分离所得培养基中挑选产酶活力较高的单个菌落，在斜面培养基上进行富集培养。将斜面培养基放入37 ℃培养箱中培养24 h .

六．【实验结果】