骨肉瘤肺转移相关基因的最新研究进展

doi:10.3969/j.issn.1671-1971.2010.04.023
骨肉瘤是源于间叶组织以能产生骨样组织的梭形基质细胞为特征的恶性肿瘤，占原发性骨的恶性肿瘤的首位。

随着手术、放疗以及化疗水平的提高，骨肉瘤患者的５年生存率已明显提高，但仍有大部分患者死于肺转移。

骨肉瘤的肺转移涉及一系列过程，包括肿瘤细胞从原发瘤成功地进入循环系统、在循环系统的存活、定居转移灶、浸润周围的组织、转移灶肿瘤血管的生成、肿瘤的生长等[1]。

因此，成功转移的肿瘤细胞必然有别于非转移的肿瘤细胞。

近年来随着肿瘤转移基因调控下的多阶段、多因素、多步骤理论的不断完善，人们对于肿瘤转移这一极为复杂的病理过程有了更进一步的认识。

发现并证实与肿瘤转移过程高度相关的基因已成为肿瘤转移机制研究领域的热点，因为基因研究不但使我们可以更深入了解肿瘤转移机制，更重要的是，这些基因及其产物有可能成为抗肿瘤转移的靶点或观察肿瘤患者预后、转移的指标。

治疗现状和面临难题
骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发恶性骨肿瘤。

按照加拿大每年50～75例和美国1000例新发病例计算，中国每年有6000～7000例新病例。

骨肉瘤好发于骨增长时期，起病时无典型临床症状，极易与外伤或生长痛混淆，恶性程度高，早期极有可能发生肺转移，死亡率高，是家庭的灾难，同时也给社会带来极大的负担。

在20世纪70年代化疗出现之前，肢体骨肉瘤虽然以截肢为主，但80%的患者仍不可避免的死于肺转移。

1979年美国纽约纪念医院癌症中心的Rosen提出了新辅助化疗概念，成为骨肉瘤治疗史上的重要里程碑。

新辅助化疗强调大剂量术前化疗消灭潜在的全身微小转移灶，根据术后病理化疗后组织坏死率指导术后化疗，因此保肢代替了大部分截肢，就诊时无肺转移患者五年生存率也由20%升高到50%～60%。

但近30年来，骨肉瘤的治疗没有大的突破，就诊早期出现肺转移的患者，５年生存率仍低于20%；就诊早期无肺转移的患者，５年生存率没有明显提高，且25%～50%的患者在化疗过程中出现了肺转移。

即使改变化疗方案，对肺转移灶的消除或控制也是效果甚微。

单一肺转移灶可以考虑手术切除，但对于多发转移灶仍没有好的方法，因此骨肉瘤肺转移仍然是当前进一步提高生存率的瓶颈。

目前，发现对骨肉瘤的肺转移起决定作用的基因和基因组已成为研究热点，因为这些基因既可作为早期鉴定可能发生肺转移的预测指标，也可作为治疗肺转移的新的靶点，对骨肉瘤生存率的提高具有重大的临床意义。

现就近年来与骨肉瘤肺转移的相关基因研究进行综述。

相关基因研究现状
一、基因组的研究
作为上世纪八十年代后起的一种基因研究技术，机理是用计算机将几千种基因打印在玻璃片上，一次杂交即可获得所有基因的表达情况，通过统计分析，获得上调和下调的基因组，通过筛选，建立具有潜在预后价值的分子指标——多基因组合。

随着基因芯片技术的不断完善和发展，基因组在骨肉瘤中的研究也越来越广泛。

2001
年，Khanna等[2]用基因芯片技术筛选小鼠成骨肉瘤转移相关基因，得到53个差异表达基因。

其中有l0个基因与骨肉瘤的转移的多个过程密切相关。

它们分别是ITGB4、CTGF、ITGA5、VIL2 ITGB2、LGALS3、ADAM8、CLU、FARP1和CP基因(它们分别属于细胞骨架、黏附、血管生成类)为了进一步证实VIL2 (编码Ezrin蛋白)与骨肉瘤转移的相关性，该作者通过构建小鼠骨肉瘤肺转移模型，进一步证实了Ezrin的表达与转移肿瘤细胞的生存能力有关。

目前关于Ezrin的表达与骨肉瘤肺转移的相关性已被越来越多的学者所认同。

2003年Leonard等[3]利用基因芯片技术分析骨肉瘤原发灶和转移灶中的基因表达，发现有13个基因(TAFII 28、IRF4、Xanthine dehydrogenase、B94、TTF-I、L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase、U1 snRNP 70K protein、MCT、CD73、Ataxia telangiectasia mutated、histamine N-methyltransferase、Arginase、MSS4)在转移灶中高表达，其中CD73和IRF4与骨肉瘤细胞的抗氧化和淋巴细胞活化密切相关，同时也证实了Ezrin蛋白与骨肉瘤肺转移的相关性。

Nakano等[4]通过建立裸鼠骨肉瘤的肺转移模型，并利用基因芯片分析技术，证明有７个基因在高转移性细胞亚群和低转移性细胞亚群之间的表达水平不同，其中５个基因(AxL、TGFA、COLL7A1、WNT5A、MKK6)与肿瘤的活性、黏附力和侵袭能力有关，表明活性、黏附力和侵袭能力不同是决定骨肉瘤肺转移的关键。

范德刚[5]等联合运用基因芯片和反义寡核苷酸技术研究两组转移水平不同的骨肉瘤细胞系的基因表达情况，发现有11个基因与骨肉瘤的发生发展密切相关，其中BRCA1和BLCAP基因与骨肉瘤细胞的生长速度、克隆形成率、增殖活性密切相关。

此外，Srivastava等[6]通过基因芯片技术筛选出WT1基因的表达和骨肉瘤的预后密切相关，并通过免疫组化研究91例骨肉瘤证实了WT1的高表达与高恶性骨肉瘤肺转移的预后密切相关；Dalla-Torre等[7]运用基因芯片筛选出THBS3、SPARC、SPPI等与骨肉瘤的发生发展以及转移和预后密切相关，并运用PCR研究40例骨肉瘤中的３种基因的表达证实了THBS3高表达的骨肉瘤更容易发生转移(P=0.058)和预后更差(P=0.02)。

可见在骨肉瘤的研究中基因组研究的作用越来越明显，但由于其成本高，价格昂贵，且信号检测的灵敏度不高，各个实验室所获得的基因也不同，而且这些基因在骨肉瘤肺转移中所承担的角色以及与临床表征的关系尚未清楚，故基因芯片技术尚未用于临床。

而候选基因的研究作为一种传统的基因研究手段在临床研究中仍起着很重要的作用。

二、候选基因研究。

通过不断发现新的基因，研究该基因在肿瘤发生、发展和预后中的作用，或结合其他已知基因构成新的分子预后指标，目前在肿瘤的研究中仍处于举足轻重的地位。

1. 细胞周期调控的主要基因
恶性肿瘤细胞的一个显著特点为细胞周期的失调控。

细胞周期素(cyclin)和细胞周期素依赖蛋白(CDK)基因的异常，抑癌基因P53突变或失功能以及RB基因的异常，这些都是恶性肿瘤发生发展的重要分子机制。

骨肉瘤中常见CDK4基因的扩增、P53基因的异常发生在50%的骨肉瘤中、RB 基因缺失的家族中骨肉瘤的患病率大大增加。

另外MDM2、P16、P21、P27、Ras、Myc和fos等基因在骨肉瘤中的研究也很多，然而这些基因的改变在肺转移患者和非肺转移患者之间没有显著性差异，对骨肉瘤的发生发展可能起到一定的作用，但对骨肉瘤肺转移不起主要的作用。

新的基因不断被发现，对肺转移的作用也在不断得到检验。

2. HER2基因
HER2基因定位于第17号染色体上，编码分子质量为185kD的跨膜糖蛋白。

HER2基因的扩增和蛋白的高表达与人多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关，特别是乳腺癌，HER2阳性的乳腺癌淋巴结转移显著相关。

Scotlandi等[8]运用免疫组化研究了84例骨肉瘤，发现32%的骨肉瘤HER2基因扩增，与骨肉瘤的预后可能相关。

Lee等[9]通过PCR 技术发现21例骨肉瘤中均有HER2基因的扩增，而运用原位杂交技术却只有26%的骨肉瘤中有HER2扩增，两者不一致的原因尚不清楚。

Gorlick等[10]认为，HER2与组织学反应的关系有统计学意义，HER2高表达者生存率低。

然而最近的研究表明HER2和P53的表达与骨肉瘤的生物学特征之间无明显关系，HER2并不能作为骨肉瘤的预后指标。

3. VIL2基因编码的Ezrin蛋白
Ezrin蛋白是近年来研究的一个热点，其相对分子质量约为81kDa，由586个氨基酸组成，在介导细胞表面黏附分子(如CD44)与细胞骨架(通过ERM家族蛋白连接)的生理功能中起着关键作用。

Ezrin蛋白是细胞膜蛋白，是肌动蛋白——细胞
骨架连接起来的桥接蛋白，通过介导膜与细胞骨架的连接，从而产生一系列细胞功能，如细胞运动、黏附、有丝分裂、细胞极性等。

研究表明，Ezrin及ERM家族作为肿瘤转移的各环节、各通路的中心调控因素发挥重要作用。

Khanna等[2]通过RNA干扰有效抑制了Ezrin在高转移活性骨肉瘤中的表达，在构建的小鼠骨肉瘤肺转移模型中，比较抑制组与高表达组骨肉瘤细胞在肺转移灶中的生存时间长短，发现Ezrin的表达的确与转移肿瘤细胞的生存能力有关，提示Ezrin的表达与骨肉瘤的预后密切相关。

Kim等[11]通过免疫组化研究64例II B期的骨肉瘤，发现33例Ezrin蛋白表达阳性，其中有22 (66.7%)例发生了远处转移，占所有发生转移的患者(23例)的95.7%。

同年Ferrari等[12]运用免疫组化研究了95例未发生转移的骨肉瘤，其中细胞质染色阳性者占47%，细胞质和细胞膜均阳性者占53%。

随访研究发现细胞质染色阳性者的３年无瘤生存率为80%，而细胞质和细胞膜均阳性者的３年无瘤生存率仅为54%。

由此进一步证实了Ezrin 蛋白的表达与否是骨肉瘤患者预后好坏的重要指标。

目前关于Ezrin蛋白与骨肉瘤转移和预后的关系已被越来越多的学者所认同。

4. CXCR4和VEGF
CXCR4是SDF-1 (基质细胞衍生因子-1)的唯一特异性受体，分子结构是一个编码352个氨基酸且高度保守的G蛋白偶联受体，有７个跨膜结构域，其基因定位于第四号染色体上。

近来研究表明，肿瘤的转移可能与白细胞的运输有某些相似之处，作为趋化因子和它的受体SDF-1/CXCR4近年已发现和许多癌症的转移密切相关，如乳腺癌、卵巢癌、直肠癌等。

Oda等[13]运用免疫组化研究了30例发生肺转移的骨肉瘤，分析了原发灶和肺转移灶的骨肉瘤细胞中CXCR4的表达，发现原发灶表达率为33.3%而肺转移灶表达率为66.6%，提示CXCR4与骨肉瘤的肺转移密切相关(P=0.0097)。

Perissinotto等[14]在构建的小鼠骨肉瘤模型中比较CXCR4高表达与低表达的肺转移情况中，发现高表达组的５只小鼠全部发生了肺转移，而通过注射T134多肽抑制CXCR4表达的６只小鼠都没有发生肺转移，也证实了CXCR4与骨肉瘤肺转移密切相关。

VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素。

其主要生物学功能为：(1)选择性增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖并促进血管形成；(2)升高血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中。

因此多数实体肿瘤的生长，侵袭，转移能力都依靠于VEGF介导的血管的生成。

Kaya等[15]运用免疫组化研究27例原发性骨肉瘤，发现肿瘤中微血管的生成与VEGF的表达密切相关，89%的VEGF高表达的患者出现肺转移，而低表达者仅10%出现了肺转移，表明VEGF在骨肉瘤肺转移中起了非常重要的作用(P＜0.0003)。

现在越来越多的研究证实VEGF的表达与患者的预后高度相关。

Yang等[16]在构建的免疫缺陷鼠的骨肉瘤肺转移模型中，对比了VEGF高表达组和低表达组的肿瘤生长速度、大小和肺转移情况(高表达组７只老鼠８周后无１例外发生肺转移VS低表达组１/７发生肺转移)发现，VEGF在骨肉瘤的生长速度、肿瘤的大小和肺转移中起到了一定的作用。

Bachelder等[17]在研究VEGF 与乳腺癌的转移中认为，肿瘤细胞可能通过自分泌VEGF诱导CXCR4的扩增，从而参与肿瘤的转移。

Oda等[13]运用免疫组化研究骨肉瘤患者的标本也发现VEGF的表达与CXCR4有很强的相关性。

5. THBS3基因
编码细胞表面糖蛋白的基因家族中的一员，调节细胞和细胞外基质的相互作用。

THBS基因家族在血液凝固、胚胎生长、组织分化、肿瘤生长和转移、血管生成等方面都有重要作用。

Cristiane 等[7]运用PCR研究40例骨肉瘤THBS3的表达，发现与骨肉瘤转移(P=0.058)和预后(P=0.02)密切相关。

THBS3可能在骨肉瘤生长和骨肉瘤内血管生成方面起到一定的作用，从而促进了肿瘤的转移。

6. TEM7 (人肿瘤血管内皮标志物7)
一种膜蛋白，介导蛋白和蛋白之间的相互作用。

Fuchs等[18]运用RT-PCR和Western blot研究了不同的骨肉瘤细胞系TEM7 mRNA和TEM7蛋白的表达情况，发现TEM7与骨肉瘤的浸润、转移和扩增有密切联系。

进一步运用免疫组化研究92例骨肉瘤患者的标本，发现转移患者的TEM7表达远高于未转移患者(P＜0.0001)，并且TEM7的表达与患者预后密切相关，高表达者较低表达者的预后要差很多。

该作者还运用RNA干扰技术沉默高侵袭性的骨肉瘤细胞系中TEM7 mRNA的表达，发现骨肉瘤的侵袭性和转移性都大大降低(＞50%)。

Fuchs等认为TEM7与Ezrin蛋白一样在骨肉瘤的转移中发挥重要作用，TEM7是一种膜蛋百，而Ezrin蛋白是介导细胞膜与细胞骨架的连接，因此“肿瘤转移信
号”可能是首先被TEM7识别，然后传递给Ezrin蛋白，继而激活下游的多个信号传导通路，从而发挥促肿瘤转移能力。

7. PTHR1 (甲状旁腺素相关蛋白受体１)
是一种Ｇ蛋白偶联的受体，在骨的生长发育过程中起重要作用。

PTH或PTHrP与其结合激活Ｇ蛋白，通过PKA或PKC通路调节血液中的钙离子的平衡、软骨细胞的增生和成熟以及破骨细胞的活性。

许多报告证明多种肿瘤的骨转移都与PTHR1的表达密切相关，如在乳腺癌骨转移过程中，PTHR1通过破骨细胞介导骨的溶解，从而在其转移过程中发挥重要作用。

Yang等[19]研究PTHR1表达水平不同的骨肉瘤细胞系时发现高表达组的增殖、侵袭和转移能力明显增强，PTHR1转染低表达组则能使其转移能力增强，运用反义RNA沉默PTHR1则使侵袭转移能力减弱；该作者还运用RT-PCR和Western blot研究骨肉瘤患者的原发灶和肺转移中的PTHR1的表达发现，转移灶中的PTHR1的表达远远高于原发灶，从而表明PTHR1在骨肉瘤的转移过程中尤其是在骨肉瘤细胞穿过骨皮质进入循环系统的过程中可能发挥重要作用。

8. COPS3
COPS3基因位于17P11.2，该区域是恶性肿瘤发生发展过程中的常见扩增部位，如横纹肌肉瘤、恶性纤维细胞瘤、软组织肉瘤等。

恶性骨肉瘤中17P11.2也时常发生扩增。

Dartel等[20]通过CGH 和SKY方法研究11P11.2～P12在高恶性的骨肉瘤中的扩增发现，13%～19%的骨肉瘤出现该区域染色体的扩增，因此该区域极有可能存在一些癌基因，在肿瘤的生长过程中起非常重要的作用。

Dartel等[21]利用DNA微阵列分析该区域的40个候选基因，发现有多个基因如COPS3、PMP22、NCOR1和TOM1L2在骨肉瘤中高表达。

COPS3基因是COP9的亚单位，COP9调控大量细胞内生物学过程，包括细胞周期运行、细胞增殖、分化。

Yan等[22]通过PCR方法证实了COPS3基因扩增是引起17P11.2区域扩增的原因，排除了其他基因扩增的可能性；同时通过对155例骨肉瘤患者标本的研究，发现31%的骨肉瘤具有COPS3基因的扩增，存在COPS3基因扩增的骨肉瘤患者肿瘤体积显著高于未扩增者(P=0.0009)，且扩增的患者更容易发生肺转移(P=0.04)。

因此COPS3作为新的候选癌基因，其扩增和过表达在骨肉瘤的生长和肺转移中可能起一定的促进作用。

关于COPS3蛋白表达对骨肉瘤患者肺转移的预测价值和其促进肺转移的机制研究正在进行中。

9. 组织蛋白酶K
组织蛋白酶(cathepsin)是一大类主要存在于溶酶体的胞内蛋白酶，包括组织蛋白酶Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ和Ｓ等，属于半胱氨酸蛋白酶家族。

许多组织蛋白酶都与肿瘤的转移相关。

组织蛋白酶Ｋ的前体(p recurso r) 40kb，切除其Ｎ端的15个氨基酸残基的信号肽和99个氨基酸残基的前体肽后，才能成为成熟的酶(27kb)。

Husmann 等[23]运用RT-PCR和Ｗestern blot检测高侵袭和低侵袭的骨肉瘤细胞系中的组织蛋白酶Ｋ的表达量，发现高侵袭的骨肉瘤细胞系中编码组织蛋白酶Ｋ的mRNA明显扩增，组织蛋白酶Ｋ的前体蛋白在高侵袭的骨肉瘤细胞系中的表达也明显高于低侵袭的骨肉瘤细胞。

该作者还运用免疫组化染色研究了92例骨肉瘤，其中发生转移的骨肉瘤患者(18例)中50%高表达组织蛋白酶Ｋ，相比未转移的骨肉瘤患者中仅有19%的患者高表达，表明其与骨肉瘤肺转移密切相关(P＜0.04)。

此外，Dhaini等[24]对18例骨肉瘤检测细胞色素P450各亚型的蛋白表达，该酶与化疗药物代谢激活和解毒有关，发现P450CYP3A4/5的高表达与肺转移相关(P=0.0004)；Srivastava等[6]通过免疫组化研究91例骨肉瘤发现WT1 (Ｗilm’s tumor gene1)的高表达与高恶性骨肉瘤肺转移的预后密切相关；Rodriguez等[25]运用免疫组化研究36例骨肉瘤肺转移患者，发现COX-2的表达与患者的预后密切相关，高表达者预后较差。

展 望
骨肉瘤是青少年常见的骨原发性恶性肿瘤，恶性度高，进展快。

虽然化疗和手术治疗的水平不断提高，但仍然有大约一半的患者治疗失败，原因就在于肿瘤的早期转移以及耐药性的出现。

因此对于发生转移的骨肉瘤的机制研究十分重要。

虽然基因组和候选基因的研究逐渐深入，但临床上尚未有可以很好提示预后指标或肿瘤转移的分子标记。

尽管在骨肉瘤预后相关基因研究方面已取得了很多进展，但一些基因在骨肉瘤预后中的具体作用还不十分明确。

如何发挥各基因间的协同效应，实现多基因的联合应用；如何开发真实有效的目的基因；如何将基因研究安全有效
的应用于临床，将与肺转移密切相关的多基因联合构成预测肺转移的预测指标，发现新的预防和治疗肺转移的靶点，既是当前面临的问题，也是未来研究的重点。

相信不久的将来，在骨肉瘤的研究中一定能找到满意的答案。

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