第二章 蛋白质分子设计

合集下载
相关主题
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

(三)定位突变的程序
1.建立所研究蛋白质的结构模型
可以通过X射线晶体学、二维核磁共 振等测定结构,也可以根据类似物的结 构或其他结构预测方法建立起结构模型。
2.找出对所要求的性质有重要影响 的位置
• 在改造中如何恰当地选择突变残基 是一个关键问题,这不仅需要分析 残基的性质,同时还需要借助于已 有的三维结构或分子模型。
• pH稳定性
• 提高酶学性质
(二)定位突变的种类
要进行基因定位突变,改变DNA核苷酸序 列,方法有很多种,如基因的化学合成、基因 直接修饰法、盒式突变技术等。 根据基因突变的方式,分为以下三类: 插入一个或多个氨基酸残基; 删除一个或多个氨基酸残基; 替换或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目的,多采用体外 重组DNA技术或PCR方法。
Pr设计的成功与否,必须要有理论与实验 的紧密相结合
在上述的设计工作完成后,要进行合成或 突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要 求的新Pr;
Pr设计的成功与否,必须要有理论与实验 的紧密相结合
一、蛋白质分子设计的分类
• 设计的目的主要有两个:
• 一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和 指导性信息,如以此提高蛋白质的热、酸稳定性, 增加活性,降低副作用,提高专一性等;
疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及 不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力
蛋白质分子设计原理
金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要 求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂 分子,并符合正确的键长、键角以及整体的几何。
对于金属Pr,围绕金属中心的第二壳层中的相互作 用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主 链的相互作用。 最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立 体因素所决定(一是立体势垒,二是aa的位置) 结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题
甲基对硫磷水解酶基因的分析
以1393位的TGA结束的可能的ORF有八个,MW:34.4kD –ATG:368,398 bp 典型的启动子序列结构:TTGCAA-17个氨基酸-TATACT (320-365bp) 典型的核糖体结合位点:AGGA (381 bp)
结论:MPH基因的CDS: 398—1393(331aa)
Hartley等于1986年完成了一个设计目标及 解决的办法 :
• 热稳定性 • 对氧化的稳定性 • 对重金属的稳定性 • 引入二硫桥,增加内氢键数目, 改善内疏水堆积 • 把Cys转换为Ala或Ser,把Trp 转换为Phe或Tyr • 替代表面羧基,把Met转换为 Gln、Val、Ile或Leu • 替换表面荷电基团,His、Cys 以及Tyr的置换 • 专一性的改变,增加逆转数, 改变酸碱度
• 二是进行蛋白质分子裁剪拼接,即“中 改”。
一、定位突变
基于天然蛋白质结构的蛋白质分子 “小改”是指对已知结构的蛋白质进行 少数几个残基的修饰、替换或删除等,
这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方
法,主要可分为蛋白质修饰和基因定位
突变两类。
(一)定位突变的设计目标及解决方法
定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的 热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专 一性,以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关 系的研究等。
其主要活性源于二聚体;而
天然核酸酶仅消化polyC、polyU、
polyA。
• 设计步骤
设计目标 蛋白质数据库 修正设计 建立结构模型 获得目标蛋白质 检测
结构信息分析 蛋白质分子设计步骤图
序列合成
第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计
基于天然蛋白质结构的分子设计有两类 :
• 一是进行蛋白质修饰或基因定位突变, 即“小改”;
有机磷农药的长期广泛使用已经使很多水体及 土壤被严重污染,而且直接影响到人们的身体健 康。 有机磷水解酶(Organophosphorus Hydrolase, OPH)的 改造: 提高对特定底物的催化效率; 扩大底物范围; 增加酶的稳定性
Dong Y J, 2005
目的和意义
通过对MPH的结晶和三维结构的测定,研究 MPH活性中心的结构,并通过定点突变及活性测定 来验证,确定MPH的结构和功能的关系,为MPH的改 性和利用提供科学的依据和良好的材料。 OPH是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农 药降解酶,同时也是应用最为广泛的农药降解酶, 为此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲 基对硫磷水解酶的广泛应用。
分离、纯化及表征
新蛋白质
Pr突变体设计的3个步骤
利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa
利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构
预测的结构与原始的Pr结构比较,利用Pr结构-功能或结构 稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质
在上述的设计工作完成后,要进行合成或 突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要 求的新Pr;
1.根据结构信息确定残基的突变
• 最有效最直接的方法
• Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰tRNA合成酶突变体的三维结构,通过分析该 酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结 构,发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中 的3’羟基形成氢键,突变效应降低了酶的活性, 证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。
(二)蛋白质分子设计的分类
• 1.定点突变或化学修饰法
• 2.拼接组装设计法
• 3.从头设计全新蛋白质
二、蛋白质分子设计的原则
• 1.活性设计 • 2.对专一性的设计
• 3.Scaffold设计(框架)
• 4.疏水基团与亲水基团需合理分布
• 5.最优的氨基酸侧链几何排列
蛋白质分子设计原理
内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内 核中残基的相互作用决定。(内部十分保守的区域) Pr 内部都是密堆积(很少有空穴大到水分子可以结 合一个水分子或惰性气体),没有重叠 所有内部的氢键都是最大满足的(主链和侧链)。 蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应,溶剂键被蛋白 质键所取代
结论:信号肽(1-35氨基酸)。
信号肽的一般结构为: 正电荷的n-region; 疏水的h-region; 中性极性的c-region。
MPH信号肽的分析预测:马尔可夫算法 MPH具有典型的信号肽的三部分结构 结论:可能的信号肽为1-35氨基酸。
第二章
蛋白质分子设计
Chapter two Protein Design
引言
在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体 外的许多重要任务: 酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子; 抗体起到防护的作用; …… 从生态角度,蛋白质也是非常理想的物质: 生物合成不需要消耗很多能量 专一性很强 不产生副作用并且能很快降解
1、与天然的蛋白质比较,缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性 2、三级结构的确定性较差
第一节 蛋白质分子设计原理
计算机模拟 功能分析
基因构建 突变蛋白质产品 Pr 设计循环
蛋白质分子设计的流程
天然蛋白质 蛋白质结构预测 蛋白质三维结构 结构与功能的关系 数据 的输 入 蛋白质突变体设计及结构预测 几何优化及蛋白质动力学研究 结果分析与原先的结构比较 蛋白质合成定位突变 蛋白质晶体学
2.突变方法鉴定突变功能残基
• 通过引进另外一种突变来检测
• 随机突变技术
• 删除分析及连接片段扫描突变
3.利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基
• 高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维 持结构有关 。
• 非保守残基是分析的靶位点,特别是对于专一 性研究。 • 探测突变蛋白质的结构整体性质,以鉴定突变 残基。
序列设计
• 设计α螺旋时,应选择象Leu、Glu等易 于形成α螺旋的残基; • 设计全β结构时,应选择Val、Ile等易于 形成β折叠片的残基; • 而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。
溶菌酶结构
• 例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性 分子的设计
• Cutte成功设计了一个具有明显 的核酸酶活性的34肽,该肽可水 解下列底物,但活性依次降低: polyC、polyA、polyU、polyG。
(五)定位突变的应用
• RNase T1的结构改造是分于设计中的一 个成功实例 • T1核糖核酸酶含有104个aa残基,天然酶 有两对二硫键(Cys2-Cys10,Cys6Cys100,日本大阪大学的Niskikawa等人 在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键, 热稳定性增加。
T4噬菌体溶菌酶
5.突变体蛋白质的检验
• 测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定 性、催化活性等, • 并与对应的天然蛋白质进行比较,检验 突变设计的效果, • 同时进一步修正设计方案。
(四)蛋白质中功能残基的鉴定
根据结构信息
突变方法鉴定突变 功能残基
蛋白质中功能 残基的鉴定
确定残基的突变
利用蛋白质同源性 鉴定功能残基
MPH与OPH的序列比对
二者同源性仅为13.6%,确定MPH是一个有别于OPH的蛋白质。 二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解 释,推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中 活性中心结构的相似性有关。
C值表示切割点的可能性, S值表示具有信号肽的可能性
MPH信号肽的分析预测:神经网算法
蛋白质应用受限的原因
蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用,其原因:
(1)蛋白质分子量非常大(10 000-1 000 000), 不能通过化学方法生产;
(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的,在其 它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的; (3)专一性致使其应用范围受到影响。
蛋白质设计目前存在的问题
Weak
Segment of suspect origin: Segments matching vectorStrong match:
1-113, 3838-4071 bp。
真正的目标序列:114~3,837 bp。
同源序列搜索(Blastn :114-3837 bp )
1 2 3 1 The nucleotide sequence including mpd from Pseudomonas sp. WBC-3 2 Plesiomonas sp. M6的甲基对硫磷水解酶基因 匹配区为134~1866,Identities=1720 bp/1733 bp(99%) CDS: 331aa (398-1393bp) 3 Pseudomonas putida的甲基对硫磷降解蛋白基因 匹配区为168~1393,Identities=1025/1026(99%) CDS: 341aa (368-1393bp) 两个基因的CDS不一致,分别匹配于MPH的398,368-1393bp
载体污染序列的分析
在进行序列分析时,首先需确定序列是否含有载体序列的污染,如 果含有载体序列,需截去后再进行其他分析。 http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ VecScreen/VecScreen.html在线分析。
Match to Vector:
Strong
Moderate
• 二是探索蛋白质的折叠机理,如简单蛋白质骨架 的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及 本质的很好途径,也为解决蛋白质折叠问题寻找 定性和定量的规律。
百度文库 (一)蛋白质分子设计的层次 • 分为两个层次:
• 一是在蛋白质三维结构已知基础上的分 子设计 ; • 二是在三维结构未知的情况下,借助一 级结构序列信息及生物化学性质进行分 子设计工作。
3.预测突变体的结构
根据所选定的氨基酸残基位点及突 变后的氨基酸种类,利用相关软件进行 突变体的结构预测,将预测的结构与原 始的蛋白质结构比较
4.构建突变体,获得突变体蛋白
依据所设计好的突变,利用化学合 成或PCR等方法构建突变体。进行基因 测序验证突变体后,将突变体进行表达, 纯化蛋白质,获得所设计的新蛋白质。
1. 突变引入二 硫键
2. 去除Gly或引 入Pro
3. Ser38→Asp和
Asn144→Asp
图2-3 T4溶菌酶的三维结构(Gassner, et al. 1996)
红色强调的为α螺旋结构域核心中被蛋氨酸置换的10个残基
T4溶菌酶的三维结构 红色强调的为α螺旋中被置换的残基
例:甲基对硫磷水解酶(Methyl parathion hydrolase, MPH )结构和功能的研究
相关文档
最新文档