基因功能分析的基本策略硕士
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基因功能分析的基本策略硕士
•
•化学合成
•质量高，高纯度，高成本 •适用于已经验证过抑制效率的靶点序列 •不适于筛选靶点序列
基因功能分析的基本策略硕士
• 体外转录
•成本适中，省时，适用于筛选靶点序列 •不适用于长期的研究或者针对某个特定靶 点序列的大量研究
基因功能分析的基本策略硕士
•长片断dsRNA酶解法
•dsRNA在体外被RnaseⅢ家族 成员切割成siRNA •不需要验证筛选多个靶点序 列 •不适用于长期研究或者特定 siRNA序列的研究
基因功能分析的基本策略硕士
•siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
•
•AAACCAGCAGAACGTGTACGA
基因功能分析的基本策略硕士
•载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特 点
•1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）
2、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 3、其它网站
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
载体构建：
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
•通过DNA同源重组 •定向将外源基因插入宿主细胞染 色体DNA中 •从而使特定目的基因在细胞内或 生物体内失活
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
•Embryonic Stem Cells
基因功能分析的基本策略硕士
•同源重组
dsDNA形成：退火 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定
转染：瓶颈之一
含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志
效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾
基因功能分析的基本策略硕士
•1.0 •对m表RN达A量•相0.8
•0.6
•0.4
•0.2
•0
•(a)
•阴性对照组
•干扰组
•24 h 48 h
•(b)
•c-actin
•500 •300
•Pokemon
•500 •300
• •
•(d)
基因功能分析的基本策略硕士
•Pokemon •β-actin
•
•1.0 •0.8 •0.6 •0.4 •Pokemon蛋•0白.2 相对表达量•0
•阴性对照组
•
•(a)
•干扰组
•48 h
72 h
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RNA干扰的应用
基因功能分析的基本策略硕士
磷酸钙法
将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲 液中，使DNA片段与磷酸钙共沉淀并 形成大的颗粒；加入贴壁培养的细胞 中被吸收，实现转基因。
基因功能分析的基本策略硕士
•瞬时转染：
• 外源DNA不整合到宿主染色体中，可存在多 个拷贝，能产生高水平的表达，但通常只持续几 天。
•稳定转染：
➢ 利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题： 导入问题：使用高效载体传递siRNA； 给药方式：因为RNA容易被降解，如何提高
siRNA在体内的稳定性； 高选择性：如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。
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第三节 基因敲除技术
Gene Knock-out
基因功能分析的基本策略硕士
• 转染•技脂术质体法
基因功能分析的基本策略硕士
•脂质体法
•将待转染的DNA溶 液与磷脂混合，形成 脂质体结构，将脂质 体悬液加入到细胞培 养液中，与受体细胞 膜发生融合，DNA 片段随即进入细胞质 或细胞核内。
基因功能分析的基本策略硕士
电击法
在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变， 细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一 定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和 细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达 到转基因目的。
•PTGS•Tra•Fnsaccrtioprtsion
•Protein
•PTGS: Post Transcriptional • 基因功能分G析的e基n本e策S略i硕le士ncing
反向遗传学——Reverse Genetics
•Gene DNA •Gene Disruption •Phenotype
•Antisense法 •Ribozyme法
•Knock •Out 法
•抑制基因表达
•RNAi法
•观察功能变化
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基因功能分析的基本策略硕士
•基因功能分析的基本策略
RNA干扰技术 基因敲除技术 基因转染细胞模型 转基因动物模型
基因功能分析的基本策略硕士
•将某一基因从动物基因组中剔除 •或将外源基因引入动物基因组 •产生经过基因工程修饰（改造）的动 物 •实现在整体和细胞水平认识基因的功 能
•操作简便，稳定性好 •siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于 研究 •适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选 标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷的细胞株
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•4.对目标RNA的干扰
•转染靶细胞 •对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR 在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平 上进行监测
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第一节 转基因技术 transgenic technology
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转基因动物 基因转染细胞模型
转基因动物
•将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中 •通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机发生重组 •将外源基因插入到受体细胞染色体DNA中
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•后代
•受精
•植入
•全能性细胞
•假孕小鼠
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•基因转染细胞模型实验步骤
•
•真核重组表达质粒的构建； •在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒； •将重组表达质粒转染哺乳动物细胞； •重组质粒转染细胞的克隆化筛选、保存； •转染细胞表达目的蛋白、提取、鉴定。
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•siRNA •19 nt duplex
•2 nt 3’ overhangs
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•RNAi的要素：RISC
•
RNA诱导沉默复合物
•RISC对靶mRNA的切割是以内切的方式进行的，而且切割仅 发生在与siRNA同源的部分。
•5´ •3´ •3´ •5´
•5´ •3´
•5´ •3´
•3´ •5´
•5´
•3´
•3´ •5´
•targeting •vector
•target
•TK
•homologous recombination
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RNAi实例(载体法)： Target gene：c-myc
n 查找靶基因mRNA n 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 n 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo n 构建载体 n 转染 n 检测效应（包括干扰效应和生物学效应）
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•目的基因mRNA获取：
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•形成RISC复合物，降解目的mRNA
•Endonuclease
•Helicase
•5’
•Homology search activity
•3’
•Exonuclease
•RISC: RNA-Induced Silencing Complex
•5’P
•OH3’
•Target mRNA
•
转基因动物模型实验步骤
•转基因载体的构建； •将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； •将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内； •对转基因动物进行鉴定。
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•启动子
•结构基因
•转基因载体
•报告基因
•增强子
•注射
•
•转基因小鼠 •
•Southern blot
•RT-PCR •Western blot
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➢ 抗病毒——
斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎 把dsRNA转入小鼠的肝细胞，被分解成siRNA后 与小鼠体內的丙型肝炎病毒mRNA相结合，使之 分解并失去转译蛋白质的功能。
已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验 且在小鼠模型看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果
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•Sequence
•Analysis
•Homologous recombination •Overexpression •Anti-sense •RNAi
•Function
•Genetically Link
•Development •Physiology •Cell Biology
基因功能分析的基本策略硕士
•
外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可
能作为一种游离体存在。外源DNA整合到染色体中
的概率很小，通常需要通过一些选择性标记进行
反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
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第二节 RNA干扰技术
RNA Interference (RNAi)
基因功能分析的基本策略硕士
•RNA
•translation
•Protein
•Transcription •Factors
基因功能分析的基本策略硕士
•Central Dogma
•DNA
•transcription
•TGS
•TGS: Transcriptional • Gene Silencing
•RNA
•translation
基因功能分析的基本策略硕士
•RNAi机制
•Dicer
•RISC
•碱基互补 •酶解
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基因功能分析的基本策略硕士
•RNA干扰实验的基本过程
•1. 确定干扰靶点
•干涉靶点序列应具备的条件： •① 尽量避开蛋白结合位点； •② 一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征； •③ G＋C比比例为50%左右； •④ 被干涉的靶序列应该是特异性的，和其它RNA没有 同源性； •⑤ 通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找 到最有效的siRNA序列
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•RNAi 抑制基因表达的机理
•dsRNA
•Cell Membrane •siRNA
•5’P
•Dicer cleavage of dsRNA
•siRNA associated •With RISC complex
•OH3’
•Target mRNA
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显微注射法
将外源DNA在显微操作系统的辅助下， 直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的 原核内，使外源基因整合到基因组上， 制备转基因动物。
基因功能分析的基本策略硕士
基因枪法
将要转染的DNA吸附到高黏度的金 属颗粒上，在加速装置的作用下，将 这些粒子高速打入细胞或组织内，达 到转基因目的。
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
•RNAi的要素：Dicer
•加工dsRNA形成 21-23 nt 小片 段
•Dice r
•Dicer contains two RNAse III domains •long dsRNA
•
•siRNAs
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基因治疗方面
➢ 抗肿瘤—— 应用RNAi技术抑制肿瘤细胞血管 生长因子如血管生成素、angi1、angi2、 angi3及VEGF等或其受体的表达，抑制肿瘤细 胞癌基因bcl2、RAS、Tp53等突变基因及其 蛋白的表达达到抗肿瘤生长及转移的目的
基因功能分析的基本策略硕士
➢ 抗器官移植排斥反应 —— 细胞间粘附分子 -1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T 细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列 特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白 的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的 移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注 损伤。
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•提供RNAi 在线技术支持的公司（网站）
基Biblioteka Baidu功能分析的基本策略硕士
• 2.将候选的靶点序列和相应的基因组数据 库等进行BLAST比较 • 3.制备siRNA
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•siRNA制备常用的五种方法：
•化学合成 •体外转录 •长片断dsRNAs经RNase III 类降解 •siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAs •PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
基因功能分析的基本策 略-硕士
2020/11/11
基因功能分析的基本策略硕士
•后基因组研究焦点：基因功能研究
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•Central Dogma
•DNA
•transcription
•Alt. Splicing •Alt. Poly-A, •Alt. Translatin Start
•
•化学合成
•质量高，高纯度，高成本 •适用于已经验证过抑制效率的靶点序列 •不适于筛选靶点序列
基因功能分析的基本策略硕士
• 体外转录
•成本适中，省时，适用于筛选靶点序列 •不适用于长期的研究或者针对某个特定靶 点序列的大量研究
基因功能分析的基本策略硕士
•长片断dsRNA酶解法
•dsRNA在体外被RnaseⅢ家族 成员切割成siRNA •不需要验证筛选多个靶点序 列 •不适用于长期研究或者特定 siRNA序列的研究
基因功能分析的基本策略硕士
•siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
•
•AAACCAGCAGAACGTGTACGA
基因功能分析的基本策略硕士
•载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特 点
•1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）
2、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 3、其它网站
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
载体构建：
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基因功能分析的基本策略硕士
•通过DNA同源重组 •定向将外源基因插入宿主细胞染 色体DNA中 •从而使特定目的基因在细胞内或 生物体内失活
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基因功能分析的基本策略硕士
•Embryonic Stem Cells
基因功能分析的基本策略硕士
•同源重组
dsDNA形成：退火 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定
转染：瓶颈之一
含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志
效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾
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•1.0 •对m表RN达A量•相0.8
•0.6
•0.4
•0.2
•0
•(a)
•阴性对照组
•干扰组
•24 h 48 h
•(b)
•c-actin
•500 •300
•Pokemon
•500 •300
• •
•(d)
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•Pokemon •β-actin
•
•1.0 •0.8 •0.6 •0.4 •Pokemon蛋•0白.2 相对表达量•0
•阴性对照组
•
•(a)
•干扰组
•48 h
72 h
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RNA干扰的应用
基因功能分析的基本策略硕士
磷酸钙法
将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲 液中，使DNA片段与磷酸钙共沉淀并 形成大的颗粒；加入贴壁培养的细胞 中被吸收，实现转基因。
基因功能分析的基本策略硕士
•瞬时转染：
• 外源DNA不整合到宿主染色体中，可存在多 个拷贝，能产生高水平的表达，但通常只持续几 天。
•稳定转染：
➢ 利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题： 导入问题：使用高效载体传递siRNA； 给药方式：因为RNA容易被降解，如何提高
siRNA在体内的稳定性； 高选择性：如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。
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第三节 基因敲除技术
Gene Knock-out
基因功能分析的基本策略硕士
• 转染•技脂术质体法
基因功能分析的基本策略硕士
•脂质体法
•将待转染的DNA溶 液与磷脂混合，形成 脂质体结构，将脂质 体悬液加入到细胞培 养液中，与受体细胞 膜发生融合，DNA 片段随即进入细胞质 或细胞核内。
基因功能分析的基本策略硕士
电击法
在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变， 细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一 定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和 细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达 到转基因目的。
•PTGS•Tra•Fnsaccrtioprtsion
•Protein
•PTGS: Post Transcriptional • 基因功能分G析的e基n本e策S略i硕le士ncing
反向遗传学——Reverse Genetics
•Gene DNA •Gene Disruption •Phenotype
•Antisense法 •Ribozyme法
•Knock •Out 法
•抑制基因表达
•RNAi法
•观察功能变化
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•基因功能分析的基本策略
RNA干扰技术 基因敲除技术 基因转染细胞模型 转基因动物模型
基因功能分析的基本策略硕士
•将某一基因从动物基因组中剔除 •或将外源基因引入动物基因组 •产生经过基因工程修饰（改造）的动 物 •实现在整体和细胞水平认识基因的功 能
•操作简便，稳定性好 •siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于 研究 •适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选 标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷的细胞株
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•4.对目标RNA的干扰
•转染靶细胞 •对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR 在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平 上进行监测
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第一节 转基因技术 transgenic technology
基因功能分析的基本策略硕士
转基因动物 基因转染细胞模型
转基因动物
•将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中 •通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机发生重组 •将外源基因插入到受体细胞染色体DNA中
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•后代
•受精
•植入
•全能性细胞
•假孕小鼠
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•基因转染细胞模型实验步骤
•
•真核重组表达质粒的构建； •在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒； •将重组表达质粒转染哺乳动物细胞； •重组质粒转染细胞的克隆化筛选、保存； •转染细胞表达目的蛋白、提取、鉴定。
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•siRNA •19 nt duplex
•2 nt 3’ overhangs
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基因功能分析的基本策略硕士
•RNAi的要素：RISC
•
RNA诱导沉默复合物
•RISC对靶mRNA的切割是以内切的方式进行的，而且切割仅 发生在与siRNA同源的部分。
•5´ •3´ •3´ •5´
•5´ •3´
•5´ •3´
•3´ •5´
•5´
•3´
•3´ •5´
•targeting •vector
•target
•TK
•homologous recombination
基因功能分析的基本策略硕士
RNAi实例(载体法)： Target gene：c-myc
n 查找靶基因mRNA n 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 n 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo n 构建载体 n 转染 n 检测效应（包括干扰效应和生物学效应）
基因功能分析的基本策略硕士
•目的基因mRNA获取：
基因功能分析的基本策略硕士
•形成RISC复合物，降解目的mRNA
•Endonuclease
•Helicase
•5’
•Homology search activity
•3’
•Exonuclease
•RISC: RNA-Induced Silencing Complex
•5’P
•OH3’
•Target mRNA
•
转基因动物模型实验步骤
•转基因载体的构建； •将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； •将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内； •对转基因动物进行鉴定。
基因功能分析的基本策略硕士
•启动子
•结构基因
•转基因载体
•报告基因
•增强子
•注射
•
•转基因小鼠 •
•Southern blot
•RT-PCR •Western blot
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➢ 抗病毒——
斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎 把dsRNA转入小鼠的肝细胞，被分解成siRNA后 与小鼠体內的丙型肝炎病毒mRNA相结合，使之 分解并失去转译蛋白质的功能。
已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验 且在小鼠模型看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果
基因功能分析的基本策略硕士
•Sequence
•Analysis
•Homologous recombination •Overexpression •Anti-sense •RNAi
•Function
•Genetically Link
•Development •Physiology •Cell Biology
基因功能分析的基本策略硕士
•
外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可
能作为一种游离体存在。外源DNA整合到染色体中
的概率很小，通常需要通过一些选择性标记进行
反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
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第二节 RNA干扰技术
RNA Interference (RNAi)
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•RNA
•translation
•Protein
•Transcription •Factors
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•Central Dogma
•DNA
•transcription
•TGS
•TGS: Transcriptional • Gene Silencing
•RNA
•translation
基因功能分析的基本策略硕士
•RNAi机制
•Dicer
•RISC
•碱基互补 •酶解
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•RNA干扰实验的基本过程
•1. 确定干扰靶点
•干涉靶点序列应具备的条件： •① 尽量避开蛋白结合位点； •② 一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征； •③ G＋C比比例为50%左右； •④ 被干涉的靶序列应该是特异性的，和其它RNA没有 同源性； •⑤ 通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找 到最有效的siRNA序列
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•RNAi 抑制基因表达的机理
•dsRNA
•Cell Membrane •siRNA
•5’P
•Dicer cleavage of dsRNA
•siRNA associated •With RISC complex
•OH3’
•Target mRNA
基因功能分析的基本策略硕士
显微注射法
将外源DNA在显微操作系统的辅助下， 直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的 原核内，使外源基因整合到基因组上， 制备转基因动物。
基因功能分析的基本策略硕士
基因枪法
将要转染的DNA吸附到高黏度的金 属颗粒上，在加速装置的作用下，将 这些粒子高速打入细胞或组织内，达 到转基因目的。
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
基因功能分析的基本策略硕士
•RNAi的要素：Dicer
•加工dsRNA形成 21-23 nt 小片 段
•Dice r
•Dicer contains two RNAse III domains •long dsRNA
•
•siRNAs
基因功能分析的基本策略硕士
基因治疗方面
➢ 抗肿瘤—— 应用RNAi技术抑制肿瘤细胞血管 生长因子如血管生成素、angi1、angi2、 angi3及VEGF等或其受体的表达，抑制肿瘤细 胞癌基因bcl2、RAS、Tp53等突变基因及其 蛋白的表达达到抗肿瘤生长及转移的目的
基因功能分析的基本策略硕士
➢ 抗器官移植排斥反应 —— 细胞间粘附分子 -1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T 细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列 特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白 的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的 移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注 损伤。
基因功能分析的基本策略硕士
•提供RNAi 在线技术支持的公司（网站）
基Biblioteka Baidu功能分析的基本策略硕士
• 2.将候选的靶点序列和相应的基因组数据 库等进行BLAST比较 • 3.制备siRNA
基因功能分析的基本策略硕士
•siRNA制备常用的五种方法：
•化学合成 •体外转录 •长片断dsRNAs经RNase III 类降解 •siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAs •PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
基因功能分析的基本策 略-硕士
2020/11/11
基因功能分析的基本策略硕士
•后基因组研究焦点：基因功能研究
基因功能分析的基本策略硕士
•Central Dogma
•DNA
•transcription
•Alt. Splicing •Alt. Poly-A, •Alt. Translatin Start