双光子显微镜技术

双光子显微镜技术
作者：细胞生物组刘洋完整ppt请见附件
双光子显微镜问世于上世纪90年代，是结合了激光共聚焦显微镜和双光子激发技术的产物。

目前，双光子显微术以其大穿深、低光毒性、低光漂白等优点而被广泛应用于活体和活细胞/组织的成像观察。

本报告将对双光子显微镜发明的背景、实现方式、技术特点、应用领域及发展趋势进行简要介绍。

一、双光子显微镜发明的背景
光学显微镜的发展历史是一段不断提高分辨率的历史。

在传统宽场（Widefield microscope, WF）光学显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可以投射到同一焦平面上（视网膜或感光元件在此），导致被接收的光线90%是来自焦平面外的杂散光，因此宽场显微镜的成像是整个标本的重叠像，没有纵向分辨能力。

对标本内部细节的表现很差，严重影响了分辨率。

为了消除杂散光的干扰，Malvin Minsky于1957年提出了一种利用狭小针孔（Pinhole）滤除焦平面外杂散光的设想，并由G. J. Brakenhoff于1978年借助激光最终实现，这就是激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, confocal）。

与宽场显微镜不同的是，激光共聚焦显微镜在成像侧的焦点位置设置了一个针孔，只允许来自另一个焦点的荧光通过，而来自其他焦平面的杂散光则被屏蔽。

通过焦点的荧光被感光元件（光电倍增管、CCD或CMOS）接收，形成一个点的荧光强度信号。

为了解决二维成像问题，激发光通过一组高速摆动的振镜，在标本上进行X-Y方向扫描，来自扫描区域内各点的信号最后通过计算机重新合成为一张图片。

由于有效滤除了杂散光，激光共聚焦显微镜的分辨率相比宽场显微镜有了本质上的提高（横向200nm，纵向400nm），拥有了对样本的特定焦平面进行精细成像的能力（称为光学切片或“细胞CT”），解决了标本内部细节的问题。

在此基础上，激光共聚焦显微镜能够结合多种其它参数，得到重建后的三维图像（XYZ模式）、动态图（XYt模式）或光谱图（XYλ）等数据，以供后续的形态学、动力学等定量分析。

然而，针孔在滤除杂散光的同时也滤除了大部分焦平面荧光，仅有很弱的荧光到达检测器。

若要提高信号强度，势必要加大激发光功率，容易增加对活细胞的光毒性和荧光分子的光漂白。

因此，激光共聚焦显微镜在活细胞/组织成像上的应用受到了一定局限。

此外，激发光在穿透标本的过程中会被标本大量散射，以及因激发沿途荧光而损耗，所以对300um 以上厚标本的深部成像并不理想，限制了激光共聚焦在厚样本成像上的应用。

自从上世纪80年代以来，人们一直寻求降低共聚焦显微镜光害、增加灵敏度和穿深的技术改进。

直到1990年，双光子显微镜应运而生。

二、双光子显微镜的原理及技术特点
1931年，原子物理学家Maria Goeppert-Mayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中，同时吸收两个/多个光子而成激发态，即所谓的双/多光子激发（吸收）。

1961年，Kaiser 等借助激光在CaF2∶Eu2+晶体中首次观察到了双光子激发现象。

1990年，Winfried Denk利用双光子激发改造激光共聚焦显微镜，发明了双光子显微镜。

什么是双光子激发？这要从产生荧光的机理讲起。

在普通状态下，基态荧光分子吸收一个激发光的光子后，其电子被激发到一个能量较高但不稳定的激发态。

激发态电子随即回到基态，同时将多余的能量以发射光子的方式放出，这就是单光子激发。

由于整个过程中存在非辐射的能量损失，发射出的光子能量总是要小于激发光子，也就是发射光的波长大于激发光。

而在双光子激发的情况下，荧光分子可以连续吸收两个波长为原来两倍的激发光子来产生与单光子激发同样的效果。

例如在单光子激发中，NADH酶分子吸收一个350nm光子，发射出一个450nm光子；而在发生双光子激发时，吸收两个700nm光子，也可以发射出一个450nm光子。

同理，也可有三光子激发乃至多光子激发，但更难发生。

双光子激发的条件非常苛刻。

荧光分子在吸收了第一个激发光子后，等待吸收第二个光子的中间态只能维持10-17s （0.01fs），这要求激发光束中相邻两个光子的间隔必须小到10-18s （1as）才能确保发生双光子激发，换算成激发光的功率密度高达5×1012 W/cm2。

任何生物标本都无法经受如此高功率的激光照射。

为了解决这个问题，双光子显微镜普遍使用可调谐的锁模红外激光器输出飞秒级的脉冲激光。

每个激光脉冲长约10-13s（100fs），强度足够发生双光子激发，而两个脉冲间有10-8s（10ns）的间隔，使整个光束的平均能量密度下降到略高于普通共聚焦激光的水平。

双光子激发对激发光能量要求极高，所以只能在光子密度最高的物镜焦点周围发生。

相对于整个光路上都产生荧光的单光子激发，双光子激发很少产生焦平面以外的杂散光，因此：1）双光子显微镜可以不需要针孔，提高了荧光信号收集率，灵敏度随之得到提高；2）双光子显微镜的光毒性和光漂白仅发生在焦点周围的极小区域（约1um3），非常适合对活细胞、活组织的长时间成像观察。

光线在介质中的散射能力与波长四次方成反比，因此双光子激发使用的近红外波段激光在厚样本中不易被散射、损耗，穿透力远强于普通共聚焦激光。

在一般情况下，双光子激发光能够轻易达到1mm以上的穿透深度，此时的成像深度仅受发射荧光的信噪比限制。

尤其适用于毫米级厚样本、不透明样本及含色素样本的成像。

比起单光子激发，双光子激发的吸收峰和发射峰距离更远，更能避免光谱重叠，有助于提高对比度和减少假阳性信号的出现。

此外，同一种染料的双光子吸收谱往往比单光子吸收谱更宽，因此可以用一种双光子激发光同时激发数种不同的短波长荧光。

这样，在没有紫外激光器的情况下也能使用AlexaFluor 350这样的短波长染料，增强荧光搭配的灵活性。

双光子显微镜的大穿深、低光害使其迅速成为活细胞、组织和胚胎观察的有力手段。

然而它自身也存在诸多限制，不能取代目前共聚焦显微镜的地位：1）双光子显微镜的分辨率达不到普通共聚焦的水平（约差一半），成像速度无明显提高；2）双光子显微镜焦点处的光漂白和光毒性强于单光子显微镜；3）双光子激发光的热效应强，对部分活标本影响较大；4）不能用于对红外光强吸收的样本；5）双光子显微镜的激光器较复杂，购置和维护成本远高于一般激光器。

因此，对是否选择双光子成像的问题，要结合自己需求和适用条件进行分析，能用共聚焦显微镜解决的问题，就无需使用双光子显微镜。

三、双光子显微术的应用
双光子显微镜自1990年诞生以来已被广泛地应用于神经生物学、细胞生物学、代谢组学、信号转导等生命医学领域。

以下列举一些双光子显微镜解决的科学问题。

细胞形态学分析
双光子成像极强的穿透能力使得人们能够轻松地获得活体深层组织中特定细胞的三维形态信息，并在此基础上进行诸如数量、尺度、体积、形状、突起形态、荧光强度等定量分析。

引用图片展示了小鼠视皮层中间神经元在对小鼠进行暗室饲养后发生的突起形态变化。

离子信号检测
双光子成像与离子探针联用，能够实时观察并量化在体神经元或其它细胞中的离子信号，使得双光子显微镜的应用进入电生理领域。

引用图片展示了小鼠听觉皮层椎体神经元的树突棘对听觉刺激的两种不同响应方式。

细胞运动跟踪
双光子成像结合细胞标记技术，能够对特定组织中标记细胞的分布、活动范围、迁移路线、迁移速度、细胞间相互作用等特征进行测量。

引用图片展示了类风湿模型小鼠腘窝淋巴结中Naive和antigen-experienced 两种T细胞的运动模式。

血流动力学
通过直接对组织微小血管中的红细胞流进行延时成像，人们已经能够测算出血液的流速和血压并建立血流动力学模型。

而这在之前是难以想象的。

引用图片展示了小鼠脑微小血管的血压波动及血压分布模型。

胞内活动检测
双光子成像不仅被广泛用于记录组织细胞水平上的各种动态，同样可以应用于囊泡转运、细胞骨架、细胞凋亡、分子代谢等胞内动态过程的监测和分子动力学模型的构建。

引用图片展示了大鼠胰岛beta细胞中胰岛素囊泡外吐的两种不同方式。

新陈代谢监测
通过直接对组织中某些具有自发荧光的生物活性分子（如NADH、FADH2）进行双光子激发，可以对组织的物质和能量代谢情况进行监测。

引用图片展示了通过NADH自发荧光水平反映的小鼠冠状动脉末梢区的供氧情况。

四、双光子显微镜的发展趋势
目前，针对双光子显微镜的各种缺点，科学家们也在对其进行着各种技术革新，以求获得一种集双光子和共聚焦优点于一身的新型成像技术。

提升扫描速度
声光振镜：使用无机械元件的声光振镜取代现有的电光振镜，从根本上提高扫描速度。

多焦点复合扫描：将一束双光子激光通过分光和延时形成数个光束，分别扫描标本上不同的位置或深度。

提高灵敏度——二次谐波成像技术（SHG）
当强激光穿过非线性光学介质时，能够产生波长减半的二次谐波。

整个过程不发生荧光激发，也就不需要荧光染色，更没有光毒性和光漂白。

二次谐波同双光子激发一样属非线性光学现象，对物质微观结构高度敏感，有助于提高成像灵敏度。

值得注意的是，二次谐波产生的条件与双光子激发相似，因此二次谐波成像与双光子显微镜高度兼容，可在现有落射式双光子显微镜的基础上增加透射式的二次谐波检测器，升级为二次谐波双光子显微镜。

提高分辨率——双光子TIRF和双光子STED
全内反射荧光成像（TIRF）并不直接使用激发光，而是使用激发光在反射界面上的隐失波场进行激发，有效地地减小了激发范围，提高了分辨率。

双光子与TIRF联用，能在双光子的基础上进一步提升分辨率。

受激发射损耗（STED）通过环形光束来减小激发光的激发范围，从而提高分辨率。

双光子与STED连用，能在大穿深、低光害的基础上使分辨率出现飞跃。

附件：two_photon.pdf。