黑曲霉发酵生产淀粉酶

黑曲霉发酵生产α-淀粉酶

前言：

α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。自从日本研究者YasujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。

通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。

正文：

一、实验目的

1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。

2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤

3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤

4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法

二、实验原理

1.蒸汽系统：

蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。

2.温度系统：

(1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。

(2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。

(3) 发酵过程自动控温系统

3.空气系统：

空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐

4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。

5.在线控制系统

6.进出料系统：进料口（接种口）、出料口（取样口）

7.管道：包括水流通管道和气流通管道

水流通：冷却用水：水经过进水管道发酵罐夹套出水口

保温用水：关闭进出水管道阀门（水注满后）进入夹套

气流通：蒸汽发生器蒸汽管道空气过滤器/发酵罐

进入罐内空气：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐

三·方法与注意事项

㈠原则

1.通蒸汽前先关闭所有阀门

2．粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。

3．活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。

4．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。

5．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。

6．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。

8．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。

㈡空消

先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：

1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。

2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。

3．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。

4．罐压升至所需温度（121℃）时开始计时，保温保压30min。

保压方式：（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。

5．结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。近罐空气阀的尾阀要一直微开启。

注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。

㈢种子制备：接种黑曲霉于PDA液体培养基中，液体摇瓶培养。

㈣培养基配制、实消

发酵培养基配方：可溶性淀粉200 g，柠檬酸氢二铵100 g，KH2PO4 15 g，CaCl2 0.5 g，FeSO4.7H2O 0.05 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，加水定容至5 L，pH5.0，消泡剂（植物油）5 mL。

关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa（121℃），保压、保温30分钟→实消结束。

㈤冷却接种与发酵

待培养基冷却至28℃左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开进料口，迅速接种。

将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。

㈥参数监测

每隔6 h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。

Ⅰ. pH的测定：标准液校准pH计后，测定样品pH值。

Ⅱ. 生物量的测定：每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 3-5 min)离心，收集上清液用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2 h左右），然后测其干重，取平均值。

Ⅲ. 酶活：

试剂：

（1）碘液：称取0.5g I2 和5.0gKI 研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，于褐色试剂瓶内保存，避免阳光直射。

（2）稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。此溶液现配现用

（3）0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5克，加5ml缓冲液，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的缓冲液中。继续煮沸2分钟，冷却至室温，定容至100mL。此溶液需要当天配制

(4) 磷酸缓冲液（pH 6.0）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)

方法：

取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入适当稀释(6.0的磷酸盐稀释缓冲液)的酶液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色，在620 nm处测光密度。以0.5 ml水代替0.5 ml反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照（即取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入6.0的磷酸盐稀释缓冲液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色）。酶活力根据下式计算：

酶活力（u/ml）＝(R0-R)/R0×50×D，式中R0，R分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。调整D使(R0-R)/R0在0.2-0.7之间。确定在40℃、5 min 内水解1 mg淀粉的酶量为一个活力单位。

Ⅳ. 残糖量的测定：硫酸-蒽酮法测残糖含量

（1）原理

糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝