α-淀粉酶的发酵、提取和
淀粉酶的使用方法
淀粉酶的使用方法淀粉酶的使用方法淀粉酶是一种生物酶制剂，BF7658α―淀粉酶采用地衣芽孢杆菌经发酵、提取精制而成。
广泛应用于淀粉糖、酒精、啤酒、味精、食品酿造、有机酸、纺织、印染、造纸及其他发酵工业。
近年来有钓友用淀粉酶作鱼饵添加剂，发现其诱鱼效果非常显着，而且价格相对低廉，已成为钓友们制作鱼饵的优良添加剂。
淀粉酶的使用方法：1、直接添加到饵料中。
基础饵料一千克，淀粉酶一百克。
淀粉酶用适量温水溶解后，直接添加到饵料中搅拌均匀，放置半小时左右即可使用。
2、作为酶制剂糖化饵料。
淀粉酶能够把基础饵料中的淀粉发酵分解，变成淀粉糖，而且使饵料变得松软甘甜、富有粘性，增加饵料的适口性。
1〉玉米糁（或者经过脱皮的干玉米粒）一千克，用水浸泡十二小时以上，直到完全泡胀。
2〉把泡好的玉米置于锅中加凉水，加到高于玉米一厘米左右。
取淀粉酶一百克，用凉水溶解，加一半（五十克）到锅中。
3〉慢火加热，过程约半小时。
至沸腾时保持五分钟，停止加热。
4〉放置冷却到七十摄氏度左右（不很烫手的程度）时，加入另一半已溶解的淀粉酶，保温半小时后自然冷却。
5〉把已冷却的玉米用细纱布滤出水分，即可用来做基础饵料。
（滤出的水分不要丢弃，可以浓缩后再加到饵料中，其中含有麦芽糖等多种营养物质）第二种用法实质上就是工业“双酶法”生产淀粉糖的简化过程。
用这种方法处理过的玉米糁或者玉米粒，其中的淀粉已经部分或全部被糖化，玉米也变得松软甘甜，极大提高了饵料的适口性。
糖化后的玉米粒可以直接挂钩作钓饵。
糖化后的玉米糁作基础饵料，再加入适量的氨基酸、DMPT、香味剂等添加剂，配制成适用的饵料。
用糖化玉米做钓饵，对鲫鱼、鲤鱼、草鱼、鳊鱼等鲤科鱼类均有极好的诱钓效果。
α-淀粉酶的生产工艺
食品111 陈雅媚 14号
目的：
学习并掌握α－淀粉酶的制备工艺。
α－淀粉酶的背景知识
α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中， 能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄 糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之 一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及 淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发 酵以及纺织等许多行业。本次设计的淀粉酶发 酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以 BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出 了生产工艺流程图，详细的介绍了α-淀粉酶的 生产工艺。
3 4 5 6 7
可溶性淀粉溶液 温度条件和 保持时间 斐林试剂 温度条件和 保持时间
2ml
煮沸 1mil
有砖红色沉淀
2ml
煮沸 1mil
无砖红色沉淀
2ml
煮沸 1mil
无砖红色沉淀
实验现象
The end
谢谢 本次课程到此结束
取三支洁净试管，编上号，并分别按下表中序号1至5要求操作。
序 号 1
项
目
试
管
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
可溶性淀粉溶液
1 2ml
60º C热水
2 2ml
沸水
3 2ml
冰块
2
3 4 5
温度条件 (保持5min)
新鲜淀粉酶溶液 （保持5min） 碘液（滴）
1ml 1
不变蓝
1ml 1
变蓝
1ml 1
变蓝
实验现象
二、PH对酶活性的影响
4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间， 物质的添加无法达到均匀。 5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多 工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应 器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。
枯草杆菌生产_淀粉酶的研究
１０科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ２０１０ ＮＯ．２９Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ研 究 报 告α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。
α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。
目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。
我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。
现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。
总产量上万吨。
近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。
但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。
本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。
１ 材料和方法１．１实验材料１．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。
１．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。
１２１℃灭菌３０ｍｉｎ）１．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。
α-淀粉酶
α-淀粉酶在结构上的相似性使人们相信它们具有相似的 催化机制。McCarter、Davies均提出α-淀粉酶的催化过 程包括三步，共发生2次置换反应。第一步，底物某个 糖残基要先结合在酶活性部位的-1亚结合位点，该糖基 氧原子被充当质子供体的酸性氨基酸(如Glu)所质子化;第 二步，-1亚结合位点的另一亲核氨基酸(如Asp)对糖残基 的Cl碳原子进行亲核攻击，与底物形成共价中间物，同 C 时裂解Cl-OR键，置换出底物的糖基配基部分;第三步， 糖基配基离去之后，水分子被激活(可能正是被刚去质 子化的Glu所激活)，这个水分子再将Asp的亲核氧与糖残 基的C1之间的共价键Cl-Asp水解掉，置换出酶分子的Asp 残基，水解反应完成。在第二次置换反应中，如果进攻 基团不是水分子，而是一个带有游离羟基的糖(寡 糖)ROH，那么酶分子的Asp残基被置换出后，就发生了 糖基转移反应而非水解反应。
在米曲霉的Taka-淀粉酶A(TAA)中，在活性部 位发现有三个酸性氨基酸残基，Asp206， Glu230，Asp 297，定点突变研究发现它们 是催化所必需的氨基酸。研究发现TAA中这 三个催化所必需的氨基酸在其它的α-淀粉酶 以至于α-淀粉酶家族中也是共有的。
Tonozaka(1993)通过对不同来源的37个α-淀粉酶基因分支酶基因，异 淀粉酶基因等进行同源序列的比较，微生物与动物和植物产生的α-淀 粉酶的氨基酸序列之间的同源性不超过10%，但发现这些淀粉酶有 ABCD四个区域有高度的保守性，推测这些保守区域与其底物的结合 或催化中心有关。 尽管不同来源的α-淀粉酶在氨基酸序列上是不同的，但它们却共同拥 有相同的基本次级结构，如(β/α)8结构(亦称之为TIM－桶)——由8个螺 旋包围8个β-折叠组成的筒状结构。该结构被认为具有催化能力的结 构。 YJanec k，S.通过对α-淀粉酶家族研究发现大部分α-淀粉酶除了含有 八个(β/α)桶状结构的催化中心(domain A)外，还包括domains B、C和 D。其中domain B具有三个β折叠和三个α螺旋，长度和结构随来源的 不同而变化。Domain C区是催化区域后面的区域，主要由β折叠组成， 该区被认为有保护催化中心疏水氨基酸的稳定性的作用。 另外，有一些α-淀粉酶包含一个没有催化功能的淀粉结合位点(starchbinding domain)。 此外，几乎所有α-淀粉酶都是金属酶，每个酶分子至少含有一个钙离 子，钙离子使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定 性。
α-淀粉酶的生产工艺流程
α-淀粉酶的生产工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!α-淀粉酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、制药、洗涤剂等行业。
α淀粉酶
6制药和临床化学分析
已有报道，基于α一淀粉酶的液体稳定试剂已应用于全自动生化分析仪(CibaComingExpress)临床化学系统。
二α—淀粉酶的研究现状
1国内α一淀粉酶研究现状
1965年，我国开始应用淀粉芽孢杆菌BF一7658生产一淀粉酶，当时只有无锡酶制剂厂独家生产。1967年杭州怡糖厂实现了应用α一淀粉酶生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7％～10％，提高出糖率10％左右。1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。l979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用，取得了良好的经济效益。
2淀粉的液化作用和糖化作用
α一淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。淀粉被转化为高果糖玉米糖浆(HFCS)。由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的α一淀粉酶。α一淀粉酶在淀粉液化上的应用工艺已经相当成熟，而且有很多相关报道。
3纤维脱浆
由于α一淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。国内有代表性的研究单位有：四川大学，主要研究α一淀粉酶的生产菌株及其培养条件；江南大学，主要研究α一淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性；西北大学，主要研究α一淀粉酶的变性机理以及环境对α一淀粉酶的影响；华南理工大学，主要研究α一淀粉酶的固定化和动力性质；还有华中农业大学，中国科学院沈阳应用生态研究所，天津科技大学，南开大学生命科学学院，中国农业科学院，中国科学院微生物研究所等多家研究机构对多种α一淀粉酶生产菌的一淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。国外有代表性的研究单位有：加拿大的UniversityofBritishColumbia，他们对人胰腺的一淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦的Carlsberg实验室主要研究大麦α一淀粉酶结构域与结合位点；美国的WesternRegionalResearchCenter主要研究大麦的α一淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦α一淀粉酶的活性位点。
实验6：α淀粉酶固定化
实验预期结果： 水解产物糊精遇碘呈红色.
固定化酶技术生产果糖浆的图示：
把酶固定在反应柱上 有何好处？
反应柱能连续使用半 年，大大降低了生产 成本，提高果糖的产 量和质量。
三、 酶的固定化方法
1、物理吸附法：将酶吸附到固体吸附剂表面的 方法，固体吸附剂多为活性碳、 多孔玻成格子型或 包埋成微胶囊型
酶的固定化方法
酶 物理吸附法 交联法 包埋法
直接使用酶和固定化酶的优缺点
类型 优点
不足
直接 使用 酶
催化效率高，低耗 对环境条件非常敏感，容易
二 、酶的特点 ①天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机 溶剂等条件非常敏感，容易失活 ②溶液中酶很难回收，不能再次利用，提 高了生产成本 ③反应后，酶会混在产物中，影响产品质量， 难以在工业生产中广泛应用
固定化酶：将水溶性的酶用物理或化学的方法固 定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活 性的制剂。
能、低污染等
失活；溶液中的酶很难回收，
不能被再次利用，提高了生
产成本；反应后酶会混在产
物中，可能影响产品质量.
固定 化酶
酶既能与反应物接 一种酶只能催化一种化学反 触，又能与产物分 应，而在生产实践中，很多 离，同时，固定在 产物的形成都通过一系列的 载体上的酶还可以 酶促反应才能得到的 被反复利用
• 实验原理：用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂 上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后， 可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试， 流出物呈红色表明水解产物糊精生成.
淀粉 α-淀粉酶 糊精 β淀粉酶 麦芽糖 糖化淀粉酶 葡萄糖
α-淀粉酶
根据淀粉酶对淀粉的水解方式不同，可将其分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶等。
其中，α-淀粉酶（α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的α-1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。
α-淀粉酶来源广泛，主要存在发芽谷物的糊粉细胞中，当然，从微生物到高等动、植物均可分离到，是一种重要的淀粉水解酶，也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取。
不同来源的α-淀粉酶的性质有一定的区别，工业中主要应用的是真菌和细菌α-淀粉酶。
目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶。
如在淀粉加工业中，微生物α-淀粉酶已成功取代了化学降解法；在酒精工业中能显著提高出酒率。
其应用于各种工业中对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。
相对地，关于α-淀粉酶抑制剂国内外也有很多研究报道，α-淀粉酶抑制剂是糖苷水解酶的一种。
它能有效地抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，降低人体糖份吸收、降低血糖和血脂的含量，减少脂肪合成，减轻体重。
有报道表明，α-淀粉酶可以帮助改善糖尿病患者的耐糖量。
α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在1984年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。
现在，α-淀粉酶已广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业和造纸工业。
在焙烤工业中的应用：α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期在啤酒酿造中的应用：啤洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加α-淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较大的场合，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖含量，提高麦汁率，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩短了整体糊化时间。
α-淀粉酶的分离提纯
α- 淀 粉 酶 的 分 离 方 法 的 比 较 α-淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。目前工 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途 业上从发酵液中提取α淀粉酶的方法多 淀粉酶的方法多。 业上从发酵液中提取 淀粉酶的方法多。 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝-超滤 超滤-乙醇 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝 超滤 乙醇 沉淀方法 。 种方法食品工业上不能使用。 第一 种方法食品工业上不能使用。 第二种方法要求发酵液澄清度好， 第二种方法要求发酵液澄清度好，否则超滤膜堵 此外超滤法浓缩酶液是有限度的， 塞， 此外超滤法浓缩酶液是有限度的，沉淀仍消 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在55%左 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在 左 右。 为了提高产品的活性,酶活性的回收和减少乙醇的 为了提高产品的活性 酶活性的回收和减少乙醇的 用量已有相关报道用大孔吸附树脂吸附的方法分 离纯化α- 淀粉酶 。在此进一步改进了洗脱方式， 离纯化 在此进一步改进了洗脱方式， 使其更便于工业化生产， 使其更便于工业化生产，使用离子交换的方法进 一步纯化α- 淀粉酶。 淀粉酶。 一步纯化
吸附树脂法发酵液cacl加水溶解加入絮凝剂搅拌压滤收集滤液滤液中加入吸附树脂过滤弃去滤液收集吸附树脂收集滤液40的乙醇过滤5乙醇成品收集沉淀沉淀无水乙醇洗脱ph为650005mollph为6502mollph为6505moll反复洗涤de32处理好的de32转入烧杯过夜制3cm4cm的层析柱2mlmin的流速平衡2h2mlmin洗脱酶液得洗脱峰1收集洗脱液测酶活性2mlmin洗脱酶液得洗脱峰2收集洗脱液测酶活性称取树脂吸附淀粉酶1g10ml注意
出峰图
注意！！！
–N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经 皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮 肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无 毒物质。沉淀α-淀粉酶过夜 α
α-淀粉酶的生产工艺
a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。
1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。
保菌供下次实验用。
1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。
②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。
④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。
⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。
倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。
然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。
⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。
把disc培养皿经37C,24h分别培养。
⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。
淀粉酶的提取-α-淀粉酶的提取、分离及测定
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chroma togra phy)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromat ograp hy, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Mart in 为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
微生物工程工艺原理_发酵产物的提取与精制方法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂 接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极 性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池” 。
2、 影响反胶团萃取的因素 （1）溶液的pH
pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质
（2）溶液的离子强度
影响微胶团的静电状态
常见的超临界流体 CO2、氨、乙烯、乙烷、丙烷、丙烯、乙醇、丁醇、 水等 由于CO2的临界温度、临界压力较易达到，而且
化学性质稳定，无毒、无臭、无色、无腐蚀性，容易
得到较纯产品，因此是最常用的超临界流体。
3、某些常用流体的物理特征
4、超临界流体萃取设备
SFE的基本流程是： 由钢瓶提供高纯液体 （CO2）经高压泵系统， 流入保持在一定温度 （高于Tc）下的萃取池。 在萃取池中可溶于SCF 的溶质扩散分配溶解在 SCF中，并随SCF一起 流出萃取池，经阻尼器 减压获升温后进入收集 器，多余的SCF排空或 循环使用。
二烷基磷酸盐/ 异辛烷反胶束溶液萃取,并用缓冲液将混合液的
pH 值调至9. 0 ,则溶菌酶完全进入有机相中,而肌红蛋白则留 在水相.
四、超临界流体萃取
超临界流体是处于临界 温度和临界压力以上，介于 气体和液体之间的高密度流 体。在临界温度以上压力不 高时与气体性质相近，压力 较高时则与液体性质更接近， 由此形成的超临界流体的性 质介于汽液两相之间，并易 于随压力调节的特点。
pH 值的变化也会导致组成体系的物质电性发生变化，也 会使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。
（3）离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离 子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束, 存在一穿过相界面的电势差(Donnan 电势) ,它是影响荷电
淀粉酶的提取--α-淀粉酶的提取、分离及测定
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。
气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。
20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。
α-淀粉酶的发酵、提取和
4
医学课件ppt
2. 在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲 (H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用， 形成紫色或紫红色的络合物，这个反应 叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含 有很多与双缩脲结构相似的肽键（－CO －NH－），因此，蛋白质可与双缩脲试 剂发生颜色反应。 此络合物在540nm吸 收值在一定范围内与蛋白质的质量成正 比.
先将固体硫酸铵研成细粉末，然后按37% （重量/体积比）的比例加入到经离心的发 酵液中，混合均匀， 静置30min。
具体操作:5ml发酵液,加1.87克硫酸铵细粉 末,混匀, 静置30min.
两组配平,4000r.m.p离心10分钟, 离心去 除上清液保留沉淀。测活前加入10ml去离 子水溶解。(即稀释一倍)
5
医学课件ppt
3. 淀粉在碘液中会呈现紫色。α-淀粉酶 作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1， 4键而生成糊精和还原糖。而糊精和还原 糖在碘液中不显色，故可通过预先盛有 淀粉和比色稀碘液的试管中的颜色变化 （由紫色变棕色）来辨别反应终点。
6
医学课件ppt
三、实验步骤
1. 硫酸铵沉淀法从发酵液中分离α-淀粉酶。
2. 取发酵液5ml +5ml去离子水(即稀释一倍)
3. 分别测定发酵液和提取液中的α-淀粉酶的酶活并 计算它们各自的酶比活力
α-淀粉酶的酶活测定
（1）吸取1ml标准糊精溶液，置于盛有3ml标准 稀碘液的试管中
（2） 在试管中加入2%可溶性淀粉20ml,加缓冲 液5ml,在60度水浴中平衡4-5分钟,加入0.5ml稀释酶 液,立即记时,充分混匀,1分钟后取出1ml反应液于预 先盛有3ml比色稀碘液的试管内(也需放在水浴中), 当颜色反应由紫色逐渐变成棕色,与标准比色管颜色 相同时,记录时间为反应时间(发酵液和提取液每组 各做2个重复)
α淀粉酶使用说明
α淀粉酶使用说明α淀粉酶（Alpha-amylase）是一种酶类蛋白质，广泛存在于许多生物体中，如人体、植物和微生物。
它在生物体内起着重要的消化和代谢作用。
α淀粉酶可以降解淀粉分子，将其分解为较短的链状淀粉分子或单糖，便于生物体通过消化吸收利用。
在工业上，α淀粉酶也被广泛应用于食品、饲料、纺织和制糖等领域。
下面是α淀粉酶的使用说明。
1.α淀粉酶的存储和保管：α淀粉酶是易于保存和稳定的酶类蛋白质，通常以固体或液体形式提供。
在储存和保存α淀粉酶时，应注意以下几点：-尽量避免接触高温和阳光直射，避免α淀粉酶蛋白质的变性和失活。
-将α淀粉酶存放在干燥的地方，防止受潮和导致蛋白质变性。
-在使用之前，应先检查α淀粉酶的有效期，避免使用已过期的酶制剂。
2.α淀粉酶的用途：α淀粉酶在食品加工和工业生产中有广泛的应用，具体包括以下几个方面：-食品加工：α淀粉酶可以促进淀粉的糊化和降解，用于制作糕点、面包、饼干等食品，改善食品质地和口感。
-制糖：α淀粉酶可以加速糖化过程，将淀粉转化为糖，用于制备糖浆、甜味剂和其他糖制品。
-酿造业：α淀粉酶可以促进麦芽中淀粉的糊化和酶解，提高麦芽的糖化率，用于啤酒生产和其他酒类发酵过程。
-纺织业：α淀粉酶可以用于纺织品的清洗和漂白过程中，去除淀粉残留和改善织物的手感和柔软度。
-饲料工业：α淀粉酶可以促进饲料中淀粉的降解和利用，提高饲料的营养价值和畜禽的饲料转化率。
3.α淀粉酶的使用方法：在不同的应用领域和具体使用要求下，α淀粉酶的使用方法会有所不同。
一般来说，α淀粉酶可以通过以下几个步骤实现其应用：-准备工作：首先，需要根据具体的应用需求和使用比例，确定所需α淀粉酶的使用量。
然后，将α淀粉酶适量稀释至所需的活性浓度。
-预处理：根据具体应用的要求，可以适当进行酶的预处理。
比如，将α淀粉酶与其他酶制剂混合、调整pH等。
-添加工艺：将稀释好的α淀粉酶加入到目标物质中，如食品原料、发酵液、纺织品或饲料等。
α淀粉酶
α-淀粉酶是一种内切酶， 其相对分子量约50000左 右，
作用于淀粉时，可从淀粉 分子内部随机切开α-1，4 糖苷键，不能切开α-1，6 糖苷键以及与α-1，6糖苷 键相连的α-1，4糖苷键， 但能越过支点切开内部的 α-1，4糖苷键。其水解产 物中除含葡萄糖、麦芽糖 外还含有具有α-1，6糖苷 键的极限糊精和含α-1，6 糖苷键的具葡萄糖残基的 低聚糖。
温度对酶活性有很大影响，温度升高，酶的 反应速度就增加，一般每升高十摄氏度，反 应速度可增加2~3倍,但是大多数酶都是蛋白 质，温度过高则可导致蛋白质变质，从而使 酶失活。在一定条件下，在某一温度时酶的 反应速度最大。这使得反应速度是最适反应 温度。
α-淀粉酶是一种金属酶，每分子酶含有一个 Ca² ﹢，Ca² ﹢可使酶分子保持相当稳定的构 象，从而可以维持酶的最大活性及热稳定性。 Ca² ﹢对酶的结合度，按产生菌而言依次是 霉菌＞细菌＞动物＞植物。除了Ca² ﹢其他金 属离子也可以提高酶的热稳定性。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植 物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎 都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为 稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀 粉，无差别地切断α－1，4-链。因此，其特征是 引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失， 最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外， 还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支 链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部 分具有α-1，6-键的α-极限糊精。一般分解限度 以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中， 亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄 糖）；
1.PH值对酶活性的影响
2.温度对酶活性的影响
3.金属离子对酶活性的影响
α-淀粉酶
保藏菌种
斜面活化
摇瓶种子 培养
厚层通风 发酵
种子罐扩 大培养
粗制品 沉淀 收集滤液 过滤
烘干 抽提 麸曲
离心
洗涤沉淀
风干
粉碎
精制品
α淀粉酶的发酵生产及应用
22
固体发酵缺点
限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较 受限，一般较适合于真菌。 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题， 尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针
α淀粉酶的发酵生产及应用 20
深层发酵法生产α-淀粉酶 • 停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老， 80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶 活不再升高，可结束发酵。而后向发酵液中添加 2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理 30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而 易于过滤。冷却到35℃，加入硅藻土为助滤剂过 滤。滤液加2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真 空浓缩数倍后，加（NH4）2SO4盐析，盐析物加 硅藻土后压滤，滤饼于40℃烘干，磨粉而成。按 此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为70％。
α淀粉酶的发酵生产及应用
10
• 作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度60~70， 作用pH值范围为5.5~7.0，最适pH值为6.0。 Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力， 并且对其稳定性的提高也有一定效果。可催化水 解a-1,4糖苷键，但只能催化水解直链淀粉，生成 a-麦芽糖和少量葡萄糖。 • 主要存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、 芽孢杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。可由 米曲霉、嗜酸性普鲁士蓝杆菌、淀粉液化杆菌、 地衣芽孢杆菌和枯草杆菌分别经发酵、精制、干 燥而得。 α淀粉酶的发酵生产及应用
α-淀粉酶发酵条件的优化
ｃ 【 ．淀粉 酶 （【 ，４Ｄ 葡萄 糖． 萄 糖苷 水解 酶 ） 遍分 ０１ － ． ． 葡 普 布在 动 物 、植物 和 微生 物 中 ，是 一种 重 要 的淀 粉水 解 ｌＩ。 酶
Ｙ ｏ改良法【． ｏ ２ 反应体系为 ５ ． 】 ｍＬ Ｏ５ ％淀粉＋ ． ０ ｍＬ酶 ， ５
在 ｐ ．、４ ＂ 反应 ５ ｎ后 ，加 Ｏ１ ｌ ｓ ５ Ｈ６０ ０Ｃ下 ｍｉ ．ｍｏ／ Ｈ２Ｏ４ｍＬ终 止 Ｌ 反 应 ，取 Ｏ５ ．ｍＬ 反应液 ＋ ｍＬ ０４ ５ ．ｍｍｏ／ ２ ｌ １ ＫＩ溶液 显色 ， Ｌ －
１ ． 曲霉 最初 发酵 培养 条件 ． ２米 ２ 在 ２ ０ Ｌ三 角瓶 液体培 养 ，装液 量 为 ４ ｍ ，接 种量 为 ５ｍ ０Ｌ ４ Ｌ，在 ２５ｐ ｍ ３ｒｍ、２ ℃的条件 下 培养 ７ｈ ８ ２。
目 前本实验室的米曲霉是采用诱变融合得到，其发酵的 初始培养基的配方 ，所产淀粉酶的量还不是很高，通过培养 基的优化可以提高酶的产量 ，同ｆ可以采用更为低廉的天然 ｌ 寸
通 讯作 者 ：Ｅｍａ ：ｙｚｅｇ ｊｕ ｄ ｒ － ｉｅ ｉ ｎ ＠ｆ ｕ ｌ ｌ ｈ ｎ ｅ ｃ。
它以随机作用方式切断淀粉 、糖原 、寡聚或多聚糖分子内的
ａ１ 葡 萄糖苷 键 ，产 生麦 芽糖 、低 聚糖 和 葡萄糖 等 ，是工 ． ，４ 业 生 产 中应用 最 为广 泛的 酶制 剂之 一 ，主要 应用 于 发酵 、纺 织 、饲 料 、医药等 多 种领 域 ｌ 。应 用 于各 种 工业 中对缩 短生
酶的促进作用较低。其中面粉对产酶的促进作用最大，因此
选 择 面粉 作为最 佳 唯一碳 源 。
１ 斜 面 培养基 （ Ｌ） 蔗 糖 ３ ， ＮＯ ２ Ｋ Ｈ Ｏ １ ） ： ０ Ｎａ ３ ， ２ Ｐ ４ ，
α-淀粉酶
α-淀粉酶概述摘要：α- 淀粉酶(α-1,4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中, 是一种重要的淀粉水解酶。
其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。
由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。
现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶。
α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。
α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。
本文概述了α-淀粉酶的发现和应用、分离纯化及结构性质、催化机制、工业化生产、应用现状与发展趋势等。
关键词：α-淀粉酶生产结构性质催化机制分离纯化应用1 α-淀粉酶的发现啤酒是最古老的酒精饮料，发酵是其关键步骤，其中所包含的糖化过程就是把淀粉转化为糖，这个转化过程的机理一直都没有被弄清楚。
在19世纪早期，Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能过被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。
Kirchhoff的实验发现奠定了发现谷物中一种能够将淀粉转化为糖的蛋白质的基础。
Payen和Persoz（1833年）发现，发酵液的酒精析出物中含有一种对热不稳定的物质，它能使淀粉转化为糖，他们将其称为“diastase”。
1886年，Lintner发现了两种淀粉酶，淀粉液化酶和淀粉糖化酶。
1924年，Kuhn将淀粉水解酶归为两类。
将发酵过程中能够将淀粉水解为β－淀粉酶，其能够将淀粉水解为β型麦芽糖。
将能够液化和糊化淀粉的酶称为α-淀粉酶，其作用于淀粉的产物表现为低旋光性，这一点为α型麦芽糖和相关糖的特性[1]。
1949年日本采用深层通风培养法生产α－淀粉酶。
1959年, 日本采用淀粉酶和糖化酶进行淀粉的液化和糖化, 确定了酶法制造葡萄糖浆的工艺, 革除了沿用100年酸水解工业, 使淀粉出糖率由80% 提高到100% 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
0.0
双缩脲试剂（ml）
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
蛋白含量（mg/ml）
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
?
震荡15分钟，室温静置30分钟后，540nm比色，以蛋白质含量（mg/ml）为横坐标，吸 光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 取发酵液5ml +5ml去离子水(即稀释一倍) 3. 分别测定发酵液和提取液中的α-淀粉酶的酶活并 计算它们各自的酶比活力 α-淀粉酶的酶活测定 （1）吸取1ml标准糊精溶液，置于盛有3ml标准 稀碘液的试管中 （2） 在试管中加入2%可溶性淀粉5ml,加缓冲液 5ml,在60度水浴中平衡4-5分钟,加入1ml稀释酶液, 立即记时,充分混匀,1分钟后取出1ml反应液于预先 盛有3ml比色稀碘液的试管内(也需放在水浴中),当 颜色反应由紫色逐渐变成棕色,与标准比色管颜色相 同时,记录时间为反应时间(发酵液和提取液每组各 做2个重复)
四、 思考题 1．活性回收率通常小于1，有没有可能大于1， 为什么？ 2.双缩脲法测定蛋白质质量，只与待测蛋白质 质量有关，而与分子量无关，为什么？ 实验报告 清洁
发酵培养基
摇瓶发酵：500ml三角瓶内装发酵培养基 50ml，其组成为：玉米粉7%，豆饼粉5%， 磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钠 0.15%，灭菌前ph7.0~7.5，灭菌后 ph6.5~7.0.接种后置往复式摇床（往复次数 96次/分钟），37±1℃下培养44~48小时。 所有比例均为重量体积比 g/ml 共装三瓶，每瓶50ml，共计150ml
2. 在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲 (H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用， 形成紫色或紫红色的络合物，这个反应 叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含 有很多与双缩脲结构相似的肽键（－CO －NH－），因此，蛋白质可与双缩脲试 剂发生颜色反应。 此络合物在540nm吸 收值在一定范围内与蛋白质的质量成正 比.
3. 淀粉在碘液中会呈现紫色。α-淀粉酶 作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1， 4键而生成糊精和还原糖。而糊精和还原 糖在碘液中不显色，故可通过预先盛有 淀粉和比色稀碘液的试管中的颜色变化 （由紫色变棕色）来辨别反应终点。
三、实验步骤 1. 硫酸铵沉淀法从发酵液中分离α-淀粉 酶。 先将固体硫酸铵研成细粉末，然后按37% （重量/体积比）的比例加入到经离心的发 酵液中，混合均匀， 静置30min。 具体操作:50ml发酵液,加18.5克硫酸铵细 粉末,混匀, 静置30-60min. 两组配平,4000r.m.p离心10分钟, 离心去 除上清液保留沉淀。测活前加入10ml去离 子水溶解。
2.双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线 取7支试管，编号，按下表加入试剂：
管 试 剂 1 2 3 4 5 6 7 号
标准蛋白溶液（ml）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Hale Waihona Puke 1.00.5 ml (待测蛋白) +0.5 ml（0.1M NaOH
0.05M NaOH（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
α-淀粉酶的发酵、提取和活性测定
背景知识
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广 泛存在于动植物和微生物中。α-淀粉酶作 用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4键 而生成糊精和还原糖。产物的末端葡萄糖 残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。 如枯草杆菌BF7658 α-淀粉酶，广泛应用于 食品、酿造、制药、纺织以至石油开采等 许多方面。
一、实验目的 通过以α-淀粉酶的发酵生产为实例，学 习和掌握酶的液体发酵和盐析沉淀法提 取纯化的基本原理和过程，掌握α-淀粉 酶分析方法、发酵和提取的评价标准。
二、实验原理 1、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉 淀法，即：通过加入不同的金属盐破坏 酶的水化层同时中和酶的表面电荷，而 使酶快速的形成沉淀，得到分离纯化。 本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适 量的硫酸铵，对发酵液中的胞外α-淀粉 酶进行纯化提取。
计算: 酶活性单位:以1克酶粉或1ml酶液于60 度,pH为6.0的条件下,在1小时内液化可溶性 淀粉的克数表示（u） 淀粉酶活力单位=(60/t *5*2%*f)/体积 试中f表示酶的稀释倍数,t为反应时间 淀粉酶比活力=活力单位/蛋白质含量（u/mg） 活性回收率=（提取液酶活×提取液体积）/ （发酵滤过液酶活×用于盐析沉淀的发酵滤 过液体积）