α-淀粉酶的发酵、提取和

2.双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线 取7支试管，编号，按下表加入试剂：
管 试 剂 1 2 3 4 5 6 7 号
标准蛋白溶液（ml）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.5 ml (待测蛋白) +0.5 ml（0.1M NaOH
0.05M NaOH（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
计算: 酶活性单位:以1克酶粉或1ml酶液于60 度,pH为6.0的条件下,在1小时内液化可溶性 淀粉的克数表示（u） 淀粉酶活力单位=(60/t *5*2%*f)/体积 试中f表示酶的稀释倍数,t为反应时间 淀粉酶比活力=活力单位/蛋白质含量（u/mg） 活性回收率=（提取液酶活×提取液体积）/ （发酵滤过液酶活×用于盐析沉淀的发酵滤 过液体积）


一、实验目的 通过以α-淀粉酶的发酵生产为实例，学 习和掌握酶的液体发酵和盐析沉淀法提 取纯化的基本原理和过程，掌握α-淀粉 酶分析方法、发酵和提取的评价标准。


二、实验原理 1、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉 淀法，即：通过加入不同的金属盐破坏 酶的水化层同时中和酶的表面电荷，而 使酶快速的形成沉淀，得到分离纯化。 本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适 量的硫酸铵，对发酵液中的胞外α-淀粉 酶进行纯化提取。

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2. 在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲 (H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用， 形成紫色或紫红色的络合物，这个反应 叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含 有很多与双缩脲结构相似的肽键（－CO －NH－），因此，蛋白质可与双缩脲试 剂发生颜色反应。 此络合物在540nm吸 收值在一定范围内与蛋白质的质量成正 比.

3. 淀粉在碘液中会呈现紫色。α-淀粉酶 作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1， 4键而生成糊精和还原糖。而糊精和还原 糖在碘液中不显色，故可通过预先盛有 淀粉和比色稀碘液的试管中的颜色变化 （由紫色变棕色）来辨别反应终点。





三、实验步骤 1. 硫酸铵沉淀法从发酵液中分离α-淀粉 酶。 先将固体硫酸铵研成细粉末，然后按37% （重量/体积比）的比例加入到经离心的发 酵液中，混合均匀， 静置30min。 具体操作:50ml发酵液,加18.5克硫酸铵细 粉末,混匀, 静置30-60min. 两组配平,4000r.m.p离心10分钟, 离心去 除上清液保留沉淀。测活前加入10ml去离 子水溶解。
0.0
双缩脲试剂（ml）
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
蛋白含量（mg/ml）
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
?

震荡15分钟，室温静置30分钟后，540nm比色，以蛋白质含量（mg/ml）为横坐标，吸 光度为纵坐标，绘制标准曲线。



2. 取发酵液5ml +5ml去离子水(即稀释一倍) 3. 分别测定发酵液和提取液中的α-淀粉酶的酶活并 计算它们各自的酶比活力 α-淀粉酶的酶活测定 （1）吸取1ml标准糊精溶液，置于盛有3ml标准 稀碘液的试管中 （2） 在试管中加入2%可溶性淀粉5ml,加缓冲液 5ml,在60度水浴中平衡4-5分钟,加入1ml稀释酶液, 立即记时,充分混匀,1分钟后取出1ml反应液于预先 盛有3ml比色稀碘液的试管内(也需放在水浴中),当 颜色反应由紫色逐渐变成棕色,与标准比色管颜色相 同时,记录时间为反应时间(发酵液和提取液每组各 做2个重复)



四、 思考题 1．活性回收率通常小于1，有没有可能大于1， 为什么？ 2.双缩脲法测定蛋白质质量，只与待测蛋白质 质量有关，而与分子量无关，为什么？ 实验报告 清洁
发酵培养基


摇瓶发酵：500ml三角瓶内装发酵培养基 50ml，其组成为：玉米粉7%，豆饼粉5%， 磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钠 0.15%，灭菌前ph7.0~7.5，灭菌后 ph6.5~7.0.接种后置往复式摇床（往复次数 96次/分钟），37±1℃下培养44~48小时。 所有比例均为重量体积比 g/ml 共装三瓶，每瓶50ml，共计150ml
α-淀粉酶的发酵、提取和活性测定
背景知识

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广 泛存在于动植物和微生物中。α-淀粉酶作 用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4键 而生成糊精和还原糖。产物的末端葡萄糖 残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。 如枯草杆菌BF7658 α-淀粉酶，广泛应用于 食品、酿造、制药、纺织以至石油开采等 许多方面。