免疫组库测序

4、免疫组库构建 构建免疫组库表达谱，统计多样性抗体库 克隆表达情况 免疫组库多样性呈现，绘制V/J基因表达的 2D、3D图
5、免疫组库差异分析 样品间多样性差异分析（辛普森系数、香
6、IR-SEQ存在的问题
1、构建免疫组库的过程实际上是基于多重引 物PCR来覆盖BCR或TCR序列多样性的过程， 这就会涉及多重引物之间扩增效率导致的 偏好性的问题，一套好的多重引物总会平 衡各对引物之间的扩增效率以及尽量避免 引物间的非特异性扩增和二（多）聚体， 可以说构建的免疫组库质量的好坏直接取 决于其多重引物质量的高低。
库全貌，我们可以通过增加样本量的方式
来弥补单个人外周血免疫组库不能反映免
3、免疫组库的多重引物并不通用，每个物 种甚至每个种系的引物都可能不尽相同。 这意味着每研究一种新的物种的免疫组库， 我们都要重新设计合成该物种的多重引物 以及PCR条件等。另一反面，有的物种胚系 基因序列不全甚至没有，这也给多重引物 的设计带来一定的麻烦。
Fra Baidu bibliotek
4、BCR/TCR多样性产生机制
1. 不同VDJ基因片段组合的多样化； 2. 不同基因片段连接时随机插入删除造成连
接的多样化，V(D)J连接区核苷酸的插入和 删除，体现为互补决定区簇CDR3)序列多 样性； 3. 不同重链和轻链组合的多样化； 4. 以及 B 细胞受体特有的随机高频突变。
5、研究免疫组库的流程
高效靶向覆盖-运用多重PCR设计实现平均 97%靶向覆盖
读长-可选择200bp或400bp读长
5、信息分析
1、基本数据统计 数据过滤，对原始数据进行去除接头污染序 列及低质量reads的处理 数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效 数据构建
数据统计，数据产出统计及测序数据的成分 和质量评估
2、数据比对分析 比对分析，与数据库（IMGT）V/D/J基因片 段比对
4、主流测序技术及优缺点
免疫组库分析的精确性依赖于HTS数据的 可靠性。而HTS数据的可靠性又依赖于测序 的准确性和覆盖的深度。
Thermo测序平台
Ion Torrent:革新性的半导体芯片测序技术 平台
原理是：向 DNA 聚合物中加入 dNTP，会 释放出氢离子。我们采用半导体测定这些 氢离子引起的 pH 变化，通过同时测量数百 万起此类变化，可以测定各个片段的序列。
二、免疫组库测序
1、免疫组库测序概念
免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为 研究目标，用多重PCR技术或5’RACE扩增决 定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR） 多样性的互补决定区（CDR3区），再结合 高通量测序技术（HTS），全面评估免疫系 统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的 关系。
影响免疫组库组成的因素有很多种。比如 年龄、疾病、免疫记忆、免疫缺陷遗传疾 病、疫苗、器官移植、癌症治疗等。
根据淋巴细胞DNA来源的不同，对于免疫组 库的研究分为以下几大类：健康人士一般 采用抽取外周血的方式；特殊人群比如白 血病人或者白血病细胞微小残留病（MRD） 患者，为了深入研究其免疫组库的变化也 将骨髓血作为淋巴细胞DNA的来源；刚出生 的婴儿，其脐带血可以用于研究人在出生 早期与母亲在免疫组库方面的联系与区别； 而对于动物来说尤其是小型动物，脾脏也 是常见淋巴细胞的DNA来源脏器。
IR-SEQ
目录
一． 免疫组库（IR） 二． 免疫组库测序技术 三． 信息分析
1、免疫组库概念
免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指 在任何指定时间，某个个体的循环系统中 所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。研 究免疫组库就要测定免疫系统中的BCR和 TCR的基因或RNA分子序列。
1. 提取样本DNA/RNA:根据所要研究的问题 设计试验方案，提取血液或组织样本，分 离B细胞或T细胞，然后提取和纯化 DNA/RNA。
2. 构建测序文库:根据不同实验情况加入不同 扩增引物进行PCR扩增，从而扩增出想要 测序的免疫基因，最后构建测序文库。
3. 测序:利用二代高通量测序仪，如Roche 454、Illumina Hi Seq2500、Illumina Mi
2、两种PCR技术的优缺点
Arm-PCR是最新开创的一种高效扩增子救援多重 PCR，它克服了传统多重PCR的缺限。通过在扩 增的早期使用基因靶点特异性的引物，而在指数 扩增期使用共用的引物，使得所有模板的扩增效 率大大提高，因而具有较高的特异性和灵敏性。
3、模板比较
基因组虽然DNA容易制备，但PCR扩增过程 中易产生非产出性的重组序列，且J-C区之 间存在的大量内含子使其下游引物只能位 于J区，PCR扩增的敏感性一般由细胞的拷 贝量决定；相对而言，RNA需取自新鲜的标 本，其产物多为产出性的CDR3序列，下游 引物可选自C区，具有高度的敏感性。
以唾液和尿液作为淋巴细胞DNA来源的方式。
2、BCR
B细胞受体（BCR）又称为免疫球蛋白 （IG），它是由B细胞分泌的可以和抗原结 合的蛋白质分子。成熟的B细胞可以将IG分 泌到细胞外面以中和抗原。免疫球蛋白由 两条重链（heavy chain, H），两条轻链 （light chain, L）中间通过二硫键连接而成。 重链（IGH）由 Variable（V），Diversity （D），Joining（J）和Constant（C）基因 片段重组而来；轻链（IGL）只由V-J-C重组 而来。重链（H链）又分为V区、C区、跨膜 区及胞质区；而轻链（L链）则只有V区和C
2、以人体内BCR为例，保守估计BCR的种 类多样性在1011这一数量级级别上，其中骨 髓方面占17%，全身淋巴结占到28%，脾 脏和粘膜系统占23%，外周血方面仅占2%， 其他约占30%。然而我们对人免疫组库的 研究往往是以来源方便的外周血，显然外 周血对免疫组库多样性的贡献率2%远远不 足，为了能尽量完全地反映人群的免疫组
决定B淋巴细胞识别抗原的关键部位是最具 多样性的重链CDR3区，其多样性的产生源 于IGHV（51个功能性基因片段）末端IGHD(23个功能性基因片段）-IGHJ前端（6 个功能性基因片段）基因重排及V-D和D-J连
接时非模板依赖性核苷酸插入或剪切和体 细胞高频突变等。
3、TCR
T细胞受（TCR）是由T细胞分泌的膜蛋白分 子，与BCR不同的是TCR只在细胞表面而不 分泌出去。一个T细胞的TCR可以是α链和β 链组成的，或者由γ链和δ链组成的。α链和γ 链由V-J-C基因片段重组而来，β链和δ链由VD-J-C基因片段重组而来，这也类似于BCR的 重链和轻链。参与特异性免疫应答的T淋巴 细胞主要是α/β T淋巴细胞，占外周Ｔ淋巴细 胞的90-95%。TCR β 链CDR3在抗原特异性 识别中起关键作用，是直接与抗原肽的结合
据推测，胚系VDJC基因片段随机组合、重 排以及TCR α/β链和γ/δ 链V区基因重排产生 的TCR克隆数量高达1015-1018，构成多样性 极其丰富的T淋巴细胞抗原受体库。不同T 淋巴细胞克隆有不同序列或长度的TCRCDR3基因，翻译出不同的CDR3多肽序列， 从而反映T淋巴细胞功能状态。在发生特异