RL代谢通路以及相关基因三 - 天津大学研究生e-Learning平台
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此代谢通路中，关键步骤为RhlA（鼠李糖基转移酶1链A） 催化下HAA的合成（β-羟基烷酰基-β-羟基烷酸）；RhlB（鼠李 糖基转移酶1链B）催化下dTDP-L-鼠李糖作为糖供体，HAA作 为受体的合成单糖双酯的反应；RhlC（鼠李糖基转移酶2）催化 下在鼠李糖基的2号碳上连接一个鼠李糖从而合成双糖双酯的反 应。 除此之外，dTDP-L-鼠李糖的合成在细菌细胞中原本就存 在，HAA合成的前体物质合成也存在。并且不是影响RL合成的 主要因素，因此这些步骤不需进行设计改造。
开题报告
鼠李糖脂（RL）产生菌O-2-2的基因改造
林福建
天津大学化工学院
2013-06-28
• • • • •
一、RL的研究近况 二、RL代谢通路以及相关基因 三、发表文章中已使用的技术手段 四、拟开展工作
五、拟采用的技术路线
2
一、RL的研究近况
3
1、国内外产业化现状
产量
技术
工业化
大庆沃太斯鼠李糖脂 发酵液年生产能力为 1.2万吨， 年产500t鼠 李糖脂干粉。是目前 国内最大工业生产线
11
三、发表文章中已使用的技术手段
山东大学的郝东辉博士毕业论文“采油微生物筛选、鼠李糖脂产酯性能及关键 酶基因的克隆与表达研究”(08年）主要研究内容和结果如下： 1）产鼠李糖脂的原油降解菌的筛选与鉴定：以原油为唯一碳源和能源，从油田样品 中分离筛选原油烃类降解菌SH6，并鉴定其为铜绿假单胞菌。利用TLC、IR分析验证 其活性代谢产物为RL。 2）鼠李糖脂理化性质和乳化活性的研究。 3）碳氮源对RL生产的影响
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三、发表文章中已使用的技术手段
加拿大威尔夫大学Rahim等人在“Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2,an enzyme responsible for dirahmnolipid biosynthesis”（01years）中提到：双糖双酯是在 rhlC催化下在单糖双酯上再连接一个鼠李糖。rhlC是一个分子 量为35.9kDa由325个氨基酸组成的蛋白质酶，为了确定RhlC的 生物功能，经插入突变和等位置换获得的突变菌株RTII-2不能 产双糖双酯但是能够产单糖双酯，同时获得PAO1-rhlA突变株 （rhlA基因被破坏），其既不能产生单糖双酯又不能产生双糖 双酯。经转入含有rhlC的质粒后的RTII-2则恢复了与野生型 PAO1相同的产双糖双酯水平，并进一步研究了rhlC的操纵子的 组成。
4）鼠李糖脂转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达研究：对SH6的鼠李糖脂转移 酶结构基因RhlAB和RhlABRI操纵子进行克隆与鉴定。构建含RhlAB和RhlABRI（ RhlR和RhlI为调节因子）的重组质粒pSAOR2和pJDOR4，利用鼠李糖基转移酶自身 启动子使其在大肠杆菌SM10、DH5α中进行表达。结果表明，只转入结构基因 RhlAB的两种大肠杆菌产脂量均很低；而转入RHlABRI操纵子的两宿主产脂量均有 提高，DH5α产脂量最高达105.2mg/L。这一产量在重组大肠杆菌表达鼠李糖脂的研 究中仍是最高，而且可以避免使用IPTG带来的成本问题和操作麻烦。
5
2、技术发展状况
分离技术：传统发酵液分离技术主要有离心分离、萃取分 离和过滤分离。对于RL主要有两类分离方法：1）经典分离法 ：包括离心、沉淀、萃取等。通常步骤为离心除菌体后，用乙 酸乙酯等有机溶剂萃取上清液。通过旋转蒸发蒸干溶剂即得到 RL粗品。2）随程提取法：即在发酵的同时耦合分离工艺，包 括泡沫分离、酸解聚沉、树脂吸附等。
6Hale Waihona Puke Baidu
3、RL研究的主要方向
在原有培养 基成分比例的基 础上通过响应面 分析实验优化主 要成份的比例， 求出最优解，期 以获得最优发酵 条件
优化发酵工艺 （通气量、接种 量、pH控制、转 速等）
在已有菌株 的基础上对其进 行基因遗传改造， 定向获得RL高产 菌株
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二、RL代谢通路以及相关基因
8
二、RL代谢通路以及相关基因
国内
最高产量在20g/L 左右
发酵周期一般一 周左右，发酵液 中分离RL复杂、 生产成本高。
国外
产量普遍可达 10~30g/L
发酵多采用各类 Rhamnolipid Inc.但无 植物油作为碳源。 工业化报道。
4
2、技术发展状况
发酵技术：发酵方式上有传统的液态发酵以及较为新的固 态发酵、 泡沫发酵等。采用生产菌种多为自行分离出的铜绿假 单胞杆菌，野生菌产量与通过诱变、分子改造菌株相比较低。 所选择的碳氮源为植物油和硝酸盐时RL产量提高。具体发酵工 艺上，限制氮源浓度来获得最大产物产出率最常见，最佳C/N 一般从8~52不等。发酵方法上研究最多的还是液态发酵，只是 基于各个亚种的性状改变其发酵条件，如限制某些底物浓度， 维持偏酸性的pH，流加操作提高发酵产量等。 德国专利最新报道新的铜绿假单胞菌种DSM7107和DSM可 以生产高浓度的鼠李糖脂70~120g/L（96年）。最近没有高产鼠 李糖脂的专利。
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三、发表文章中已使用的技术手段
山东大学的李清心博士毕业论文“鼠李糖脂合成酶RhlA和RhlB基因的 克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和应用研究”（2005年）：该文 章分别将RhlA和RhlB用高表达的系统pET在大肠杆菌中进行了表达。其中， RhlA是一个分子量为33kDa的蛋白，在大肠杆菌内表达了含有6个组氨酸（ His-tag）的重组RhlA蛋白，然后，通过亲和层析和FPLC分子筛层析的方法 对其进行了纯化，并通过蛋白质印迹的方法，用特异性的检测6个组氨酸的 单克隆抗体证明了所纯化的蛋白是正确的。 利用电转化的方法将含有RhlAB的pVLT质粒转入石油微生物P22和P8( 石油环境中筛选所得)中，构建了高效产生鼠李糖脂的工程菌株，并通过RTPCR分析了诱导后RhlA和RhlB在受体菌中的表达情况。实验发现，受体假 单胞菌P22和P8在转入RhlAB基因后鼠李糖脂的产量都有较大提高，并且产 量都明显高于铜绿假单胞菌的产量。 产量提高方面鼠李糖脂最高为3.8mg/ml，该论文主要是研究了在石油降 解方面的作用产量提高不大。
开题报告
鼠李糖脂（RL）产生菌O-2-2的基因改造
林福建
天津大学化工学院
2013-06-28
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一、RL的研究近况 二、RL代谢通路以及相关基因 三、发表文章中已使用的技术手段 四、拟开展工作
五、拟采用的技术路线
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一、RL的研究近况
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1、国内外产业化现状
产量
技术
工业化
大庆沃太斯鼠李糖脂 发酵液年生产能力为 1.2万吨， 年产500t鼠 李糖脂干粉。是目前 国内最大工业生产线
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三、发表文章中已使用的技术手段
山东大学的郝东辉博士毕业论文“采油微生物筛选、鼠李糖脂产酯性能及关键 酶基因的克隆与表达研究”(08年）主要研究内容和结果如下： 1）产鼠李糖脂的原油降解菌的筛选与鉴定：以原油为唯一碳源和能源，从油田样品 中分离筛选原油烃类降解菌SH6，并鉴定其为铜绿假单胞菌。利用TLC、IR分析验证 其活性代谢产物为RL。 2）鼠李糖脂理化性质和乳化活性的研究。 3）碳氮源对RL生产的影响
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三、发表文章中已使用的技术手段
加拿大威尔夫大学Rahim等人在“Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2,an enzyme responsible for dirahmnolipid biosynthesis”（01years）中提到：双糖双酯是在 rhlC催化下在单糖双酯上再连接一个鼠李糖。rhlC是一个分子 量为35.9kDa由325个氨基酸组成的蛋白质酶，为了确定RhlC的 生物功能，经插入突变和等位置换获得的突变菌株RTII-2不能 产双糖双酯但是能够产单糖双酯，同时获得PAO1-rhlA突变株 （rhlA基因被破坏），其既不能产生单糖双酯又不能产生双糖 双酯。经转入含有rhlC的质粒后的RTII-2则恢复了与野生型 PAO1相同的产双糖双酯水平，并进一步研究了rhlC的操纵子的 组成。
4）鼠李糖脂转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达研究：对SH6的鼠李糖脂转移 酶结构基因RhlAB和RhlABRI操纵子进行克隆与鉴定。构建含RhlAB和RhlABRI（ RhlR和RhlI为调节因子）的重组质粒pSAOR2和pJDOR4，利用鼠李糖基转移酶自身 启动子使其在大肠杆菌SM10、DH5α中进行表达。结果表明，只转入结构基因 RhlAB的两种大肠杆菌产脂量均很低；而转入RHlABRI操纵子的两宿主产脂量均有 提高，DH5α产脂量最高达105.2mg/L。这一产量在重组大肠杆菌表达鼠李糖脂的研 究中仍是最高，而且可以避免使用IPTG带来的成本问题和操作麻烦。
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2、技术发展状况
分离技术：传统发酵液分离技术主要有离心分离、萃取分 离和过滤分离。对于RL主要有两类分离方法：1）经典分离法 ：包括离心、沉淀、萃取等。通常步骤为离心除菌体后，用乙 酸乙酯等有机溶剂萃取上清液。通过旋转蒸发蒸干溶剂即得到 RL粗品。2）随程提取法：即在发酵的同时耦合分离工艺，包 括泡沫分离、酸解聚沉、树脂吸附等。
6Hale Waihona Puke Baidu
3、RL研究的主要方向
在原有培养 基成分比例的基 础上通过响应面 分析实验优化主 要成份的比例， 求出最优解，期 以获得最优发酵 条件
优化发酵工艺 （通气量、接种 量、pH控制、转 速等）
在已有菌株 的基础上对其进 行基因遗传改造， 定向获得RL高产 菌株
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二、RL代谢通路以及相关基因
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二、RL代谢通路以及相关基因
国内
最高产量在20g/L 左右
发酵周期一般一 周左右，发酵液 中分离RL复杂、 生产成本高。
国外
产量普遍可达 10~30g/L
发酵多采用各类 Rhamnolipid Inc.但无 植物油作为碳源。 工业化报道。
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2、技术发展状况
发酵技术：发酵方式上有传统的液态发酵以及较为新的固 态发酵、 泡沫发酵等。采用生产菌种多为自行分离出的铜绿假 单胞杆菌，野生菌产量与通过诱变、分子改造菌株相比较低。 所选择的碳氮源为植物油和硝酸盐时RL产量提高。具体发酵工 艺上，限制氮源浓度来获得最大产物产出率最常见，最佳C/N 一般从8~52不等。发酵方法上研究最多的还是液态发酵，只是 基于各个亚种的性状改变其发酵条件，如限制某些底物浓度， 维持偏酸性的pH，流加操作提高发酵产量等。 德国专利最新报道新的铜绿假单胞菌种DSM7107和DSM可 以生产高浓度的鼠李糖脂70~120g/L（96年）。最近没有高产鼠 李糖脂的专利。
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三、发表文章中已使用的技术手段
山东大学的李清心博士毕业论文“鼠李糖脂合成酶RhlA和RhlB基因的 克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和应用研究”（2005年）：该文 章分别将RhlA和RhlB用高表达的系统pET在大肠杆菌中进行了表达。其中， RhlA是一个分子量为33kDa的蛋白，在大肠杆菌内表达了含有6个组氨酸（ His-tag）的重组RhlA蛋白，然后，通过亲和层析和FPLC分子筛层析的方法 对其进行了纯化，并通过蛋白质印迹的方法，用特异性的检测6个组氨酸的 单克隆抗体证明了所纯化的蛋白是正确的。 利用电转化的方法将含有RhlAB的pVLT质粒转入石油微生物P22和P8( 石油环境中筛选所得)中，构建了高效产生鼠李糖脂的工程菌株，并通过RTPCR分析了诱导后RhlA和RhlB在受体菌中的表达情况。实验发现，受体假 单胞菌P22和P8在转入RhlAB基因后鼠李糖脂的产量都有较大提高，并且产 量都明显高于铜绿假单胞菌的产量。 产量提高方面鼠李糖脂最高为3.8mg/ml，该论文主要是研究了在石油降 解方面的作用产量提高不大。