活细胞工作站 及应用案例简介

活细胞工作站及应用案例介绍

关键词：活细胞工作站,CV1000,6D 活细胞成像,3D 成像,激光共聚焦显微镜,四转盘扫描,双转盘扫描,YOKOGAWA,最长扫描时间

活细胞工作站可实现在细胞水平上的定性和定量分析、活细胞图像处理、活细胞动态示踪。在分子水平上，可做到基因定位定量表达的动态分析、蛋白质合成讲解运输和相互作用的动态研究、细胞骨架的代谢动力学测定和细胞周期各时相的动态观察等。现在市场上有众多的活细胞工作站、激光共聚焦观察系统等，下面以Yokogawa 的CV1000 为例介绍此类型的活细胞工作站。

CV1000 活细胞动态成像系统是定位于长时间、多时相、6D 活细胞成像的一体化共聚焦系统，它整合了显微镜，共聚焦光路系统，以及活细胞工作站等诸多模块于一体，不需暗室操作并且集成了温度、湿度控制等繁琐过程。整套安装简易，操作简单，使用方便，并且厂家携代理商提供完善的售后服务。

CV1000 使用的四转盘共聚焦扫描头，最大限度地降低了光毒性和光漂白。CV1000 是目前唯一的能长时间对胚胎做3D 成像，然后被观察的胚胎细胞能顺利发育为健康成体小鼠的系统。该系统的精确的温度控制系统（精确度可达0.1℃），使得干细胞，胚胎，以及其他细胞可在稳定的温度环境中生长，精确地完成您的实验操作。四转盘共聚焦扫描系统，以及独一无二的为转盘共聚焦优化的双针孔设计，为活细胞的观察在技术水平上提供了双保险，使得CV1000 更适合于非常适合于精确度要求极高的生命过程的观察，如癌症，发育生物学，干细胞研究等领域的长时高速6D 成像，尤其适合于肿瘤细胞的增殖和迁移，干细胞增殖和分化，iPS 细胞成像，胚胎发育，转基因细胞，细胞周期观察等领域。

此外，在活细胞观察中至关重要的温度控制，不仅可以影响活细胞在观察过程中的生长状态，还会引起Z 轴漂移。YOKOGAWA 在CV1000 严格控制了机箱内的温度，结合其一体化的设计使得温度控制可精确到0.1℃，并在检测的14 天范围内保持恒定。其X-Y 轴的回复度也达到了业内的顶端水平，可实际操作步径精确到0.1 微米，显示步径精确到8nm。

一、主要技术优势

极低的光毒性：高速转盘式扫描（CSU 四转盘扫描系统），将光毒性降至最低；

高品质成像：极高灵敏度的EMCCD，保证图像质量；

可靠的环境控制：高精确度的温度，湿度，CO2 控制；

界面友好：人性化的操作软件，易于上手；

一体化的设计：无需暗室，防止污染，条件可控；

可调节针孔尺寸：25μm 和50μm 两种选择，保证在任何放大倍数下都能获得清晰的成像质量（10X-40X 推荐用25μm 针孔，63X-100X 推荐用50μm 针孔）。

转盘式扫描与传统单点扫描的区别：

1、单点扫描，单点激光扫描头逐点逐行的扫描样品，以PMT 采集信号，就是常见的点扫描共聚焦--即传统激光共聚焦系统。

2、转盘式是多点同步扫描，以Yokogawa 的转盘扫描头为例，转盘上分布有20000 个螺旋排列的针孔，而激光光源覆盖约2000 个针孔的范围（即扫描区域），借助转盘的转动（针孔位置随之改变），实现对样品的完整扫描。相当于2000 个激光点同步照射样品，同步激发，CCD 上同步采集，所以扫描速度非常的快。

3、微透镜增强型的双转盘式是目前活细胞共聚焦最先进的技术，它大大提高了激光的利用率，扫描速度快，灵敏度高，光漂白和光毒性水平低，最适合活细胞、快速、6D 扫描研究。

应用领域

一、细胞生物学：细胞分裂，细胞周期，微丝微管动态分布，悬浮细胞培养观察；

1. 成肌细胞的分裂：

小鼠成肌细胞的运动和分裂，在拍摄20分钟后，培养基中加入压力诱导因子。总的拍摄时间为25小时（250秒的时间间隔）。

Z stroke：20um（1um spacing, 21 slices in total）

MIP images are shown.

Total 25 hours at 250sec interval.

Objective: 60X oil

Number of Field: 25 (5 x 5)

2. 细胞周期

小鼠乳腺癌细胞用GFP（绿色）或者mCherry（红色）标记细胞组蛋白，两种细胞呈现出不同分化趋势，GFP标记的细胞分化成为肿瘤块，mCherry标记的细胞没有分化。总的拍摄时间为23小时（时间间隔10Min）。

60X oil 1.5um steps 40 steps (60um), at 10 min intervals for 23 hrs

3. 细胞培养监测

人脐静脉内皮细胞在人工基质中的培养

总拍摄时间18小时（时间间隔5Min）

Objective: 10X，图片为荧光图像和明场图像的叠加。

4. 悬浮细胞的培养观察：

CV1000不仅可以观察贴壁细胞，也可以观察悬

浮细胞。由于其精确地自动对焦和补偿系统，能

够从，X-Y（左图）和Z-X（右图）不同界面检测

细胞的生长状态，不让任何现象漏网。

此实验为转染了GFP的293F细胞的生长状态在

不同轴向的时间间隔监测。

5. 微丝

微丝在植物细胞周期中的动态变化：

二、发育生物学

1. 胚胎发育，小鼠早期胚胎的发育过程

Left：BF image Right：Confocal image

Green：Spindle（EGFP- α -tubulin）Red：Nucleus（H2B-mRFP1）

2. 模式生物-斑马鱼白细胞的运动动态观察

Green: nuclear EGFP

Red: cytosolic mKate2

Exp ：200ms

Z stroke：60um（3.2um spacing, 21 slices in total）

MIP images are shown.

Total 3 hours at 1min. interval

Objective: 20X oil

3. 大脑皮层发育

鸡大脑皮层的神经上皮细胞的区间动态核迁移监测，总观察时间达40小时（30min 的时间间隔）。

Exp：300ms

Z stroke：40um（4um spacing, 11 slices in total）

MIP images are shown

Total 40 hours at 30min. interval

Objective: 20X oil