生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析

4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
4.1.4 在免疫酶技术中的应用 BAS应用于免疫酶技术，通过生物素-亲和素将免疫复 合物与辣根过氧化物酶连接起来，形成免疫酶-生物素-亲 和素法。赵金富等用合成的雌三醇-生物素复合物(E3Biotin)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作 为免疫分析探针测定血清中的雌三醇。结果表明，具有很 高的灵敏度、稳定性、重现性和抗非特异性吸附干扰的能 力。魏孔吉等建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生 物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法，样品处理简单， 结果满意。宋晓荣等用酯化生物素标记N15C，辣根过氧 化物酶标记N16D，检测cTnT，检测灵敏度为1.0 μg/L， 特异性高。
酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤（间接法）
1 包被抗原 2 洗涤 3 待测血清（抗体） 4 洗涤 5 酶标二抗 6 洗涤 7 显示物A、B 8 加终止液 (H2SO4)
酶标板
桥-亲和素-生物素标记（BAB法）步骤
间接法步骤：
1包被抗原 2洗涤 3待测抗体 4洗涤 5生物素标二抗 6洗涤 7加亲和素 8洗涤 9加酶标生物素 10洗涤 11加底物 12显色后加终止液
4.2 在分子生物学中的应用
液相杂交
4.3 在组织化学中的应用
将混有亲和素和生物素的染料浓聚于靶细胞表面，能 使细胞与染料更好的结合，最大优点为精确度被提高，结 果简单易测，更利于靶细胞结构的观察。张志强等应用 ABC法对赤链蛇消化道5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5HT)细胞的分布密度和形态学特点进行观察，结果显示5HT在其整个消化道中均有分布。徐卫等用SAP法对儿童 急性淋巴细胞白血病(ALL)和成人患者的ALL骨髓和外周血 进行Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的检测，结果发现Ki-67抗原在 儿童ALL中的表达略低于成人。
4.1.3在胶体金技术中的应用 BAS应用于胶体金技术，其原理为带正电荷的链霉亲 和素标记的带负电荷的胶体金颗粒能与生物素紧密结合， 使检测信号在只有胶体金标记或只有BAS标记的基础上得 到扩大。吕丰等应用石英晶体微天平(QCM)研究了基于 BAS的葡萄糖氧化酶的固定化，结果在利用BAS固定过的 葡萄糖氧化酶过程中，经过纳米金颗粒修饰的QCM基片 对酶的吸附量比未经修饰的基片多。张志锋等以组装型金 磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡
2.上样
3.洗杂 4.洗脱
五 反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。 2.生物素易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，再和生物素 衍生物结合，将信号多级放大，能保持大分子物质的原有生 物活性。 3.亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度 专一性，不增加非特异性干扰，也不会因反应试剂浓度高低 受影响。 4.酸、碱、变性剂及有机溶剂均不会影响亲和素与生物素的结 合力。裴仁军等试验结果表明，链霉亲和素与生物素能够在 结合表面形成均一的多层膜维系紧密的结合。 5.BAS不仅能与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合， 还可制成亲和介质，用于分离提纯。 6.BAS操作方便，反应结果可用肉眼观察，实验成本低。
直接法：
+ B-E + A ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法
间接法
（3）标记生物素-抗生物素法 标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 应用
1
在免疫学中的应用
免疫荧光技术中的应用 免疫放射技术中的应用 胶体金技术中的应用 免疫酶技术中的应用 ELISA中的应用
2
3
4
在分子生物学中的应用 在组织化学中的应用 在分离纯化中的应用（亲和层析）
4.1 在免疫学中的应用
4.1.1 在免疫荧光技术中的应用 BAS应用于免疫荧光分析(fluorescence immunoassay，FIA)技术， 可用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素)或采用游离亲和素(或链霉亲和素)搭桥， 两端分别连接生物素和荧光素。与常规荧光抗体法或单独的BAS标记法相比， BAS标记法结合荧光抗体技术可明显地提高检测的灵敏度和特异性。 张锦明等用99Tcm替代111In标记BAS在肿瘤放免显像预定位DTPA-生物素溶液， 结果测得99Tcm-DTPA-生物素的标记率大于90%。 4.1.2 在免疫放射技术中的应用 BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联， 先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与 抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物， 再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合， 最终使反应信号放大。 李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗， 最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定， 结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星， 与传统放射性同位素杂交法相结合，构建筛选大黄鱼的微卫星。4.2 在分子生物学中的应用
• 不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称 为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例 一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的 绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂 交探针;基因组DNA结构功能的研究
卵白亲合素
亲合素
链亲合素 卵黄亲合素 类亲合素等
后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。
二 原理
20世纪60年代初发现了生物素(biontin，B)和卵白素(avidin，A)， 其亲和力至少比抗原-抗体结合力高百万倍，是目前发现的自然界中 具有最强亲和力的物质。
每个 分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物 活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子 又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素-生物素标记法(Labeled avidin biotin，LAB)、亲和素-生物素桥法(bridged avidin biotin, BAB)和 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin biotin peroxid ase complex，ABC)。 生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发 展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并 与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步 提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、 定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
接法和间接法，直接法是以游离的亲和 素(或链霉亲和素)作为桥联剂，利用亲和 素的多价性，将生物素化抗体复合物与 标记生物素(如酶标生物素)联结起来，达 到检测反应分子的目的。间接法则是在 抗原与特异性抗体结合反应后，再用生 物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结 合，从而使灵敏度进一步提高。由于生 物素化抗体分子上连有多个生物素，因 此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲和 素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分 子。加入相应酶作用底物后，会产生强 烈的酶促反应，提高检测灵敏度。Smith K A[5]利用间接BAB法检测乙型肝炎表面 抗原(HBsAg)，其灵敏度比常规ELISA高 1 000多倍。
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。
4.2 在分子生物学中的应用
BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要 集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测以及将免疫 测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗 原的检测等方面。自从合成了生物素化的脱氧三磷酸脲苷 (dUTP)和UTP等核苷酸单抗以来，以生物素化多核苷酸为 探针的核酸杂交技术有了很大发展，常用于Southern、 Northern和原位杂交等。试验时，标记探针先与细胞或染 色体原位(或是固定在乙酸纤维素膜上)的变形核酸分子进 行杂交，然后用偶联了酶或荧光物质的亲和素(或链霉亲 和素)识别杂交互补片段，使其显色或产生荧光，这种技 术克服了放射性核酸探针标记与检测的缺点，应用潜力很 大。
4.1.5 在ELISA中的应用 用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗 体，然后连接亲和素-酶结合物(BA-ELISA)、或亲 和素及酶标生物素(BAB-ELISA)或ABC试剂(ABCELISA)，从而使反应信号放大，提高检测的灵敏 度。王传彬等用生物素标记的纯化抗禽流感病毒 H5亚型血凝素单抗和酶标亲和素检测H1、H15亚 型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株， 与血凝和血凝抑制试验比较，纯化后的单抗具有 良好的反应活性。祝军等将BA-辣根过氧化物酶 复合物系统ELISA策略，对ANEPⅢ寡核苷酸适配 子的亲合力进行测定。