HPLC分离样品样品前处理方法

HPLC分离样品样品前处理方法

因为需要在仪器、柱子、溶剂和人力等方面做很大的投入，HPLC分离是一项成本很高的分离技术。而样品前处理结果的好坏对分离过程有非常明显的影响，有时会直接关系到分离的成败；如果能遵循适当的原则，做好样品的前处理，往往既提高了分离的成功率和效率，也大大降低了成本。目前分离成本是按进样针数分摊到每个项目组的，所以合成同事送分离样品前处理的好坏直接关系到所属项目的成本。样品前处理的技术比较复杂，并且跟合成反应的关联非常紧密，下面的方法是分离组根据经验总结出来的，并不完全，也希望合成同事提供更多的建议。另外，考虑到目标组分含量过低的样品会大量增加分离的难度和成本，分离组以后原则上不再接收含量低于10%的样品。

以反应中的添加剂，催化剂来分类：

1反应中使用高反应活性的物质，如三氯氧磷，二氯亚砜，NaH，LiAlH4等，反应后一定要淬灭。这一点合成同事都是了解的。但是后面的一点容易被忽视，就是要做好中和。比如三氯氧磷用水淬灭后产生磷酸和盐酸，要用弱碱中和至近中性。（近中性只是一个粗略的概念，如果可以知道样品用什么体系分离合适，最好能将样品溶液的pH调整为与该分离体系的流动相pH一致，酸性流动相pH～2,中性pH=6.8~7.5,碱性pH～10）,否则对制备柱会造成损坏.

2有些物质反应活性虽然不是很强，如多聚甲醛，但如果不淬灭，在样品溶液中，可能会继续反应，导致目标物纯度发生变化。曾经有一个样品，使用多聚甲醛，还原胺化反应实现N甲基化。本来粗品纯度很好，但是在分离过程中发现目标物纯度越来越低，原来样品结构中还有一个反应活性较弱的N，由于多聚甲醛未淬灭，这个反应活性较弱的N原子也被甲酰化，导致目标物纯度降低，这个样品分离失败。所以，反应后淬灭，中和是样品送分离前的必修课，不可偷懒。如果不按照此原则操作，样品送到分离组导致样品分离失败，或者严重的导致色谱柱损坏等，所增加的成本将会被分摊到相应的合成项目组。

3偶联反应类型中可能用到的金属催化剂，如Pd(dppf)Cl2, Pd-118, Pd2(dba)3等均相的Pd催化剂，CuI，Chan-Lam反应中会用到的Cu(Ac)2，其他还有TiCl4，钛酸四异丙酯，Fe(acac)2等。分别详细说明一下。

3.1Pd催化剂如果是非均相的，则过滤即可去除。如果使用了Pd(PPh3)4，则由

于该试剂不稳定，反应后会出现黑色Pd的沉淀，过滤也可以去除干净。如果使用过Pd(dffp)Cl2等均相的Pd催化剂，由于该试剂可以溶解于常用有机溶剂中，所以不能通过过滤去除。而如果不处理干净，Pd试剂在与流动相混合后析出，堵塞筛板，并与硅胶结合，导致反相色谱柱柱头变黑，柱压剧烈升高，色谱柱柱效严重下降，常常会出现白天摸好方法的样品，在晚上多次进样后峰型变差，纯度降低，不能满足交货要求，更严重的，色谱柱柱效的严重降低，会影响后续样品的分离，导致多个样品分离失败。所以，这类

使用过Pd催化剂的样品如果不处理，不但样品不能顺利交货，还会导致色谱柱损坏，这样做绝对是得不偿失的。针对这种情况，分离组开发了用TMT 溶液用来彻底沉淀Pd试剂的方法，去除Pd试剂对反相色谱柱的不利影响。

方法非常简单，反应后加入TMT溶液，过夜放置，第二天过滤即可。

3.2CuI，该试剂看起来好像是离子型化合物，很多同事认为该试剂易溶于水，

用萃取的方法去除CuI。其实该试剂在DMSO，DMF中有很好的溶解度，而在甲醇，乙腈溶剂中溶解度非常有限，如果样品可以使用甲醇，乙腈溶解完全，就不要使用DMSO，DMF溶解。有的合成同事看到加入甲醇后还有物质没有溶解，就加入DMSO，认为把反应瓶中的所有固体都溶解了才能保证回收率，这是不对的。把对于分离不利的物质，或者杂质都溶解进来，增加了分离的难度，甚至会损坏色谱柱。对于自己做的反应，反应物的溶解性应该有一定了解，遇到不溶的物质，可以通过点板等手段分析一下。如果确实目标物只溶解于DMSO，DMF中，可以加入TMT-DMSO溶液，但是由于在DMSO中TMT-Cu的沉淀很细小，DMSO溶液粘度又很大，沉淀会悬浮在溶液中，直接过滤也阻力很大，难以操作。需要对样品先离心，而后将上清液过滤。

3.3Cu(Ac)2是Chan-Lam反应中会用到的试剂，而且由于反应用量大，基本上

1个当量，与上述Pd试剂催化剂用量不同，加入TMT沉淀后，会产生大量沉淀，直接过滤也是不现实的。必须先离心，再对上清液过滤。由于沉淀量比较大，可以通过增加溶液体积，让更多的目标物溶解在溶剂中来提高回收率。

3.4TiCl4是一种强Lewis酸，加入水淬灭后会生成盐酸与Ti(OH)2，Ti(OH)2

进而生成TiO2沉淀，可以通过过滤去除TiO2，为了让TiO2沉淀完全，建议加入弱碱性水，如稀氨水。钛酸四异丙酯，可以通过加入弱碱性水，生成TiO2的方法处理干净。如果含有该类试剂的样品做碱性分析或者碱性分离时，会在色谱柱的塞板上生成TiO2，导致色谱柱压力升高，柱效下降，导致样品分离失败，甚至色谱柱损坏。这个问题非常严重。分离组就有一根Waters Xbridge C18制备柱，价格约5万RMB，在做了一些含有TiCl4的样品后柱压升高，不能使用。后经过使用醋酸反冲的方法处理，柱压有所下降，但柱效已经严重下降，这是因为高柱压已经破坏了柱床的结构，造成不可逆损坏。对于含有这类试剂的样品，合成同事应该做好前处理工作，如果由于这类样品导致色谱柱损坏，合成项目组将会被分摊到相应的色谱柱费用。

3.5Fe(acac)2也可以通过加入TMT沉淀，由于用量大，要离心，上清液过滤。

4缩合反应中的缩合剂。比如HOBT，EDCI这一对最常用的缩合剂。由于HOBT带有弱酸性，而EDCI反应后的氧化产物，ms174的物质为碱性，含有一个叔胺基团，当分离体系选择中性分离时，这两种物质都是出于极性最大的状态，易于通过分离去除干净。而产物为酰胺，在中性条件下保留最强，所以缩合反应的样品可以首选中性体系分离。