褐变现象

褐变现象

摘要：植物组织培养中褐变现象的原理以及影响褐变现象的因素，提出了防止褐变的措施和方法。

关键词：组织培养。褐变。

正文：

褐变是植物组织培养中一种普遍存在的现象，是由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，这种褐变现象又被称为酚污染。多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶的活性，从而毒害整个外植体，严重影响外植体的脱分化、再分化和生长。褐变这种现象与菌类污染和过度含水化(即玻璃化)并称植物组织培养的3大难题。目前褐变已成为植物组织培养发展的一大障碍[1]。

目前，在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

1 褐变产生的影响因素

影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。

1.1 植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。

1.2 外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。

1.3 培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。

1.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。

2 褐变产生的机理

2.1 非酶促褐变

非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。

2.2 酶促褐变

目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。

在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构

发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。

3防止褐变的措施

3.1选择适宜的外植体和培养条件

成功的经验表明，选择适当的外植体并建立最佳的培养条件是克服材料褐变的最主要手段[10]。选择适宜的外植体，材料的年龄、取材部位、材料的大小及外植体受伤害程度等均能对褐变产生影响。外植体材料应有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化与再分化的条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。一般情况下，取幼龄树新萌发嫩枝条的带芽茎段、嫩叶或茎尖作为外植体，也可采用幼胚来培养。另外对于某个种的植物进行培养前，在不影响培样目的的情况下，应筛选褐变低的基因型个体。

在培养条件的许多因子中，较为重要的是适宜的元机盐成分、适宜的蔗糖浓度及激素水平。培养早期的培养基中应含较低浓度的元机盐，降低Fe和Cu浓度或不用这两种离子；在保证正常培养的需求下使用低浓度细胞分裂素；愈伤组织或细胞培养物为异养型，应使培养物获得充足的氧气，以利于分化和生长。

适宜的温度及在黑暗条件下进行培养也可减轻材料的褐变。易发生褐变的外植体，可先于低温(4～20℃)预培养数小时，也可于黑暗或弱光照下预培养数日后再转入正常培养条件下培养。外植体受伤害程度直接影响褐变，切割时应尽可能减小伤口面积，并缩短切口在空气中的暴露时间。随着pH增高，多酚被氧化的作用增强，因此培养基pH值应控制在6.0以下。

组织培养的一些材料产生水解型多酚，这类外植体在培养过程中会由于多酚类物质分泌到培养基中使培养基的颜色加深，并进一步氧化为醌类物质，而多酚类物质及相应的醌类物质会抑制多种酶的活性，从而阻碍外植体对营养物质的主动吸收和转化。对于培养初期多酚类物质合成分泌的材料可以在液体培养基中预培养一段时间，使酚类物质充分分泌到培养基中，减少外植体内和外植体周围的多酚物质。对于培养过程中多酚类物质不断合成的材料在培养中要进行转移外植体到新鲜培养基中，一般转移周期在2周左右。

3.2使用抗氧化剂或增效剂

组织培养时，在培养基中加入抗氧化剂、增效剂培养或预培养，使用抗氧化剂和增效剂对材料进行预处理，可抑制外植体的酶促褐变。目前在培养基中一般

单独或组合添加V

C 、V

E

、β-胡萝卜素、硫代硫酸钠、巯基乙醇、酒石酸、柠檬

酸、亚硫酸盐、植酸、二硫苏糖醇等。V

C

和柠檬酸主要在早期起作用，随培养时间延长作用消退，亚硫酸钠在中后期作用较好，但亚硫酸盐对植物具有一定毒害作用，不宜单独添加。也可在有抗氧化剂或增效剂的无菌溶液中切割材料后再接种，这类处理适用于外植体切割后快速氧化的材料。抗氧化物质对外植体的培养会起到一定的副作用，培养基添加浓度不宜过高，一般在200mg/L以下,且多用于初期培养而不宜长期培养。还原性抗氧化剂在使用时应注意保持其还原性，因此一般最好过滤除菌使用，而不与培养基一起高温灭菌。

3.3使用吸附剂

在培养基中加入吸附剂可以抑制褐变。吸附剂有聚乙烯吡略烷酮(PVP)和活性炭(AC) 等，活性炭是吸附性较强的元机吸附剂，但在使用过程中，应尽量使用最小浓度来防止褐变，因为活性炭的吸附作用是无选择性的，活性炭浓度一般在0.1～0.5%之间。PVP是酚类物质的专一吸附剂，其对酚的结合强于酶蛋白的结合，因而可使酶从多酚一酶复合物中结合出来，从而使酶的抑制消除。但随着 PVP用量的增加，大部分组织培养物之增殖率也随之下降，这可能是由于PV P在吸附培养基中引起褐变的物质之外，还吸附了部分植物激素。PVP浓度一般在0.3%左右[11]。

3.4其它

3.4.1改变培养基的状态如采用滤纸桥培养可使外植体溢出的有毒物质很快扩散到液体培养基中，对外植体危害较轻；或采用液体培养、半固体培养、液体培养与固体培养交替进行培养等也能减轻褐变的危害。

3.4.2选择适宜的接种方式把培养体切面浸入培养基中，减少了褐化发生的表面积，且较大组织切块的创伤面积相对较小，有利于保持转培初期切块浅表层细胞或组织处于原来的生长发育状态，从而减轻了因切面褐变带来的毒害作用。

3.4.3通过试验选择适宜的消毒方式可减少对外植体的伤害程度，从而减轻褐化程度。