发酵液中谷氨酸的提取纯化

一、实验原理：
谷氨酸，学名: 2-氨基-5-羧基戊酸，为酸性氨基酸，是构成蛋白质的20 种常见α-氨基酸之一。

谷氨酸又名“麸酸” 或写作“夫酸”，是制造味精的原料。

D-谷氨酸参与多种细菌细胞壁和某些细菌杆菌肽的组成。

发酵制造L-谷氨酸是以糖质为原料经微生物发酵，发酵液中存在菌体、蛋白质、残糖、色素、其它氨基酸、有机酸等杂质。

目前国内提取谷氨酸的主要方法：1.等电点法； 2.离子交换法；
3.金属盐法；
4.盐酸水解等电法；
5.离子交换膜电渗析法。

国外大规模提取谷氨酸的方法：日本采用浓缩等电点工艺；美国采用旋转真空膜过滤。

谷氨酸等电点pI=3.22，在等电点时谷氨酸的溶解度最小，且谷氨酸的溶解度随温度降低而减小，所以调节pH以及降低温度可以令溶液中的谷氨酸析出沉淀即为等电点法提取谷氨酸。

氨基酸为两性电解质，等电点较低的谷氨酸在pH小于pI 3.2时，主要以GA+型式存在，故可用强酸性阳离子交换树脂提取，当发酵液流过交换柱时，发酵液中各成分依亲和力的不同进行交换，吸附GA的树脂再用洗脱液(5% NaOH)洗脱，收集富含GA的流分(高流液)。

二、材料与器材：
（1）实验材料：谷氨酸发酵液
（2）实验药品：NaOH、HCl、酸性离子交换树脂、壳聚糖醋酸溶液、硅藻土（3）实验仪器：圆底烧瓶、离心机、离心管、天平、玻璃棒、磁力搅拌器、一次性塑料滴管、pH计、铁架台配有十字夹、色谱柱、SBA、3mL离心管（用于柱层析接收样品）、烧杯（500mL1个；250mL1个；50mL1个）、量筒2个（10mL 和100mL，）。

三、实验步骤：
（1）发酵液的预处理
壳聚糖醋酸溶液：先配置2%体积比的醋酸溶液；然后加入壳聚糖配置成1%的壳聚糖醋酸溶液。

取100mL发酵液，再加入含量为1%的壳聚糖醋酸溶液，此时溶液pH值在5.52，谷氨酸含量为22mg/dl，加入量为发酵液体积的1.4%，轻轻搅拌加入1g硅藻土，静置2h。

（2）发酵液的固液分离
取上清测谷氨酸含量，进行固液分离,采用离心(6000rpm 20min)方式进行固液分离，再次取上清测谷氨酸含量为30mg/dL。

（3）等电点结晶法：
搅拌情况下加硫酸（3mol/L）调节pH至pH=5左右时可快些，pH=5以下，起晶前后，加酸要慢，发现晶核应立即停止加酸，缓慢搅拌育晶2 h，育晶完成后继续缓慢加硫酸，使pH值到3.0-3.2，同时搅拌并冰水浴降温至4-8℃，搅拌育晶10h，静置4h，离心取沉淀得到谷氨酸结晶粗品，显微镜下观察晶型。

测量上清中GA的含量是19mg/dL，pH值为3.12.
加酸流程
400X观察晶型
（4）离子交换法：
1.树脂的预处理
未经使用的树脂在使用之前，根据需要进行预处理。

将干树脂在烧杯中用水浸泡一定时间（浸泡过夜），充分溶胀后倾去溶胀时溶出的杂质及碎小树脂；用量筒量取25mL湿树脂（732，Na型），于小烧杯中带水在搅动悬浮下倒入柱中，将柱下端的止水夹打开，使柱内水慢慢流出，树脂自由沉降。

（要始终保持柱中水位高于树脂床2-4 cm，防止树脂夹杂气泡）新购树脂夹杂有合成过程中生成的低分子量聚合物、单体、溶胀剂、催化剂及树脂存放时进一步分解的产物、合成时容器腐蚀也会产生一些金属离子，故需要对树脂进行洗涤。

酸（碱）性树脂通常以Na（Cl）型供应。

洗涤时不管原来型式，一般都要用3倍于树脂体积的2mol/L 的NaOH、水、2mol/L HCl、水，在柱中依次交替重复洗3次，洗涤速度与交换相同，（控制约30滴/分），最后用6%（W/W）的盐酸溶液转为酸型树脂。

阳离子柱处理过程：
1.2M HCl 处理（75mL）
2.蒸馏水处理（75mL）
3.2M NaOH 处理（75mL）
4.蒸馏水处理（75mL）
5.2M HCl 处理（75mL）
6.蒸馏水处理（100mL）
2、上柱交换
将结晶后的母液85.5mL用硫酸调节PH到1.59，上柱，控制好流速（30滴/min）。

流速太快，GA来不及交换即流出。

流出液用烧杯收集，期间不断用茚三酮检验柱下流出液，证明有GA漏出，即停止上柱，关闭止水夹，量出烧杯中流出液体积。

一共收集了9管流出液，平均每管8-9mL,只有第9管中有GA流出，与茚三酮反应结果如图：
3、洗脱
洗脱是用洗脱剂（2%NaOH）将吸附的GA解吸出来。

洗脱前，用60-70℃热去离子水反洗（60滴/min），以预热树脂起到温柱以防GA在柱中析出（结柱）之作用。

待树脂自由沉降，降液面至高于床层2-4 cm，用2%NaOH洗脱，洗脱流速控制约15滴/min。

洗脱时，不断用SBA检测，并用pH试纸测试pH变化。

有GA流出时即开始收集，每2 mL收集液换一支试管，SBA生化分析仪检测GA含量。

一共收集了12管，平均每管2-3mL, 其中第4管和第5管由于有结晶析出，用60℃的蒸馏水稀释20倍后溶解。

在流出液中的pH含量较高，用2M的硫酸调节pH到6-7之间后再用SBA测量谷氨酸含量。

4、树脂的再生
钠型强酸性阳树脂酸碱交替清晰后可用10%NaCl 溶液再生，用药量为其交换容量的2倍(用NaCl 量为117g/ L 树脂)。

储存温度一般在5—40℃为宜，以免冻裂。

离子交换树脂应贮存在密封容器内，避免受冷或曝晒。

若冬季没有防冻设施时，可将树脂贮于食盐水中，食盐水的浓度可根据气温而定。

树脂一旦受冻，不要突然转到高温环境，要放到5-10℃低温环境中，让其缓慢解冻。

离子交换树脂内含有一定量地水份，在储运及应用过程中应保持这部分水份。

如不慎树脂失水，应先用浓食盐水(约10%)浸泡，再逐渐稀释，不得直接加水，以免树脂急剧膨胀而破碎。

树脂在长期贮存中，强型树脂应转成盐型，弱型树脂应转成氢型或游离碱型，然后浸泡在清净的水中。

树脂贮存期为2年。

五．结果与讨论
1.初始发酵液pH=5.52，谷氨酸含量22mg/dl，之后加入体积为发酵液1.4%
壳聚糖醋酸溶液再加1g硅藻土，静置2h。

2. 固液分离：6000rpm 离心20min ，后取上清测谷氨酸含量为30mg/dl ，pH=5.57。

3. 阳离子柱预处理过程：
2M HCl 处理（75mL）；蒸馏水处理（75mL）；2M NaOH 处理（75mL）；蒸馏水处理（75mL）；2M HCl 处理（75mL）；蒸馏水处理（100mL）。

4.上样
对静置过夜的溶液用2M硫酸调节pH到1.59，用于上柱
上柱体积使85.5mL，每次保持柱中水位高于树脂2cm，用茚三酮检测GA含量，如果加热出现蓝紫色，即可停止上样。

5.洗脱后的结果
pH值 5.069.5812.1113.2713.40
讨论：
1.固液分离后的发酵液中谷氨酸含量比预处理前的含量高？
处理前后谷氨酸的量理论来讲是不变的，不过处理前杂质会屏蔽谷氨酸的信号，去除杂质以后，谷氨酸的信号会更强一些.
2.pH值已经达到了9，但是人存在谷氨酸在流出液中？
由于发酵液氨水添加过量，导致发酵液中铵根离子的含量较高，在经过阳离子柱时优先结合，在洗脱时也会洗脱下来影响流出液中的pH含量。

同时由于洗脱液的流速比较快，在流出过程中，离子交换速率与流出速率不一致，导致后续还有部分谷氨酸存在于流出液中。

思考题：
1絮凝剂的种类？
絮凝剂按照其化学成分总体可分为无机絮凝剂和有机絮凝剂两类。

其中无机絮凝剂又包括无机凝聚剂和无机高分子絮凝剂，主要分为两大类别：铁制剂系列和铝制剂系列，当然也包括其丛生的高聚物系列。

有机絮凝剂又包括合成有机高分子絮凝剂、天然有机高分子絮凝剂和微生物絮凝剂，与传统絮凝剂相比，它能成倍的提高效能，且价格较低。

2 壳聚糖为什么要配置成酸性溶液？
壳聚糖不溶于水、碱以及一般有机溶剂，但壳聚糖可以溶解在盐酸、甲酸、乙酸、乳酸、苹果酸、抗坏血酸等许多稀的无机酸或某共有机酸中，长时间加热搅拌条件下也能溶解在浓的盐酸、硝酸、磷酸中。

壳聚糖水解，生成低相对分子质量的壳聚糖。

溶于酸性溶液形成带正电的阳离子基团。

壳聚糖在溶液中是带正电荷的多聚电解质，具有很强的吸附性。

3加入絮凝剂时的搅拌速度？
加入絮凝剂后应该缓慢持续的搅拌，搅拌那可以增加分子间的相互作用，引起分子间的布朗运动加剧，可以有效的对发酵液中的杂质进行吸附，但搅拌的速度不宜过大，过大会导致较大的剪切力，使得已经吸附在絮凝剂的杂质收到作用力从上脱落下来，影响絮凝效果。

4 硅藻土的作用？
pH值中性、无毒，由于存在大量的孔隙结构，吸附性能强，容重轻，吸油率115%，可以有效的吸附发酵液中的有色物质，以及加入的消泡剂和氨根离子，调节发酵液的性质，同时在滤纸中可提高滤液澄清度，并使沉淀加快。

5 加热的作用？
对发酵液体积进行浓缩，方便后期进行提取。

6企业常用的固液分离方法有哪些？
板框压滤，错流膜过滤，膜过滤，自由沉降
7实验室常用的固液分离方法有哪些？
离心，抽滤
8本实验何种固液分离方式？
硅藻土辅助离心，超高速离心，逐渐开始起晶，静置两小时后
9加酸速度对于晶型的影响？
在谷氨酸起晶的过程中，一般是在pH4.0-4.5达到起晶的中和点，自然起晶，停止加酸，再调节到等电点3.2开始结晶，再整个过程中，滴加硫酸的速度都是比较慢的过程，滴加速度较快会形成局部过酸，同时对已经存在的晶核造成一定的影响。

10 温度对于晶型的影响？
在谷氨酸的提取过程中，温度对于晶型的影响比较重要。

在结晶过程中，可以形成α和β两种晶型，在等电点结晶时，α-晶体是一种理想的晶体，但温度会对晶形结构产生影响。

在30℃以下会形成α-晶体，高于30℃会形成β-晶型。

11搅拌速度对于晶型的影响？
不搅拌情况下形成的晶体大小不均匀，搅拌可以使得晶体大小均匀，且防止了晶簇的产生，搅拌太快形成的结晶比较细小，搅拌太慢导致微细晶核甚至是β型结晶。

12流速对分离效果的影响？
流速不宜太快，在上样的时候，谷氨酸与柱子的阳离子交换需要一定的反应时间，流速太快会导致谷氨酸还没结合到柱子上就流出柱子。

导致后续，洗脱的谷氨酸的时候洗脱不下来。

13 如何避免“结柱”现象？
用60-70℃热去离子水反洗（60滴/min），以预热树脂起到温柱。

14树脂如何再生？见下段。

钠型强酸性阳树脂酸碱交替清晰后可用10%NaCl 溶液再生，用药量为其交换容量的2倍(用NaCl 量为117g/ L 树脂)。

储存温度一般在5—40℃为宜，以免冻裂。

离子交换树脂内含有一定量地水份，在储运及应用过程中应保持这部分水份。

如不慎树脂失水，应先用浓食盐水(约10%)浸泡，再逐渐稀释，不得直接加水，以免树脂急剧膨胀而破碎。

树脂在长期贮存中，强型树脂应转成盐型，弱型树脂应转成氢型或游离碱型，然后浸泡在清净的水中。