猪伪狂犬野毒检测(PRV-gE)

猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测

自备材料

1. 50、100μl 精确微量移液器或连续移液器。

2. 一次性移液器吸头。

3. 配制洗涤液的500ml 量筒。

4. 96 孔板酶标仪。

5. 稀释样品的玻璃或塑料管。

6. 蒸馏水或去离子水。

7. 滴加和吸去洗涤液的装置。

使用注意事项

1. 处理所有的PRV 材料以免PRV 的传播。抗原包被微孔板虽然经过化学处理，仍可能成为PRV 的传染源。

2. 勿用口移液。

3. 使用样品和试剂盒的场所不要吸烟、喝水和吃东西。

4. TMB 底物和终止液对皮肤有刺激性。

5. 试剂盒的某些成分含有防腐剂叠氮钠。处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，它们在受压时可以爆炸。注意防止该成分对酶标抗PRV gpI 抗体的污染。

6. TMB 不要暴露于强光和任何氧化剂。使用洁净的玻璃或塑料容器盛装TMB 底物液。

7. 所有的试剂应在2－7℃储存。使用前恢复到室温，使用后放回2－7℃。

8. 所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染环境。

9. 注意防止试剂盒成分的污染。

10.不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒的成分不要混用。

11.严格遵守这些条款可以获得理想的结果。操作过程中的移液、时间和洗涤必须精确。

样品的制备

用样品稀释液将被检样品稀释2 倍 (1:2)。

取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在滴加到PRV 包被板前应混匀。

洗涤液的制备

浓缩洗涤液应在使用前恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10 倍稀释（例如：每块板用30ml 浓缩液加上270ml水）。

操作步骤

使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。

1.取出抗原包被板，在记录表上记录样品的位置。

2.在A1，A2 和A3 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阴性对照。

3.在A4，A5 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阳性对照。

4.在其余的孔内分别加入100μl 已稀释好的被检样品。

5.室温下孵育1 小时或2－8℃孵育过夜(可以将微量反应板用封条封闭)。

6.用大约300μl 洗涤液洗涤板孔，重复3－5 次。每次洗涤时洗涤液都应吸出丢弃。在洗板和加入标记物之间应避免包被板变干。在最后一次洗涤液吸出后，将板中残留洗涤液扣拍到吸水材料上。

7.每孔加入100μl 辣根过氧化物酶标记抗PRV gpI 抗体。

8.室温下孵育20 分钟。

9.重复步骤6。

10.每孔加入100μl TMB 底物液。

11.室温下孵育15 分钟。

12.每孔加入50μl 终止液，使反应终止。

13.测量并且记录被检样品和对照的A(650)。

14.计算结果。

结果

阴性对照A(650)的平均值减去阳性对照A(650)的平均值必须大于或等于0.3，试验方能有效。如果试验无效，试验操作可能有误，试验应重做，并应详细阅读说明书。首先通过计算每个样品的S/N 值，判定其gpI 抗体的有无。

计算方法

1. 阴性对照平均值的计算（NC）

NC =A1A(650)+A2A(650)+A3A(650)/3

阳性对照平均值的计算（PC）

PC＝A4A(650)+A5 A(650)/2

3. 样品/阴性对照比率的计算（S/N）

S/N=样本A(650)/NC

结果判定

1.如果S/N值低于或等于0.60，样品应判定为PRV gpI抗体阳性。

2.如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，样品应重测。如果试验结果不变，间隔一定时间后重新采样、检测。

3.如果S/N值大于0.70，样品应判定为PRV gpI抗体阴性。

注意：确定阳性应作两次重复。