胶原蛋白提取及氨基酸序列

管圆线虫胶原蛋白基因的测序与表达

生命科学学院08级3班 09080319 吴星星一．胶原蛋白介绍

胶原蛋白又名胶原质, 是由动物细胞合成的一种生物性高分子, 是构成动物结缔组织的主要蛋白

质, 广泛存在于骨、腱、软骨、皮肤等结缔组织中,在脊椎动物中约占总蛋白的1/3。最常见的3 种胶原是Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原, 其中Ⅰ型胶原是成年动物皮中的主要胶原形式。胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸的含量是各种蛋白质中含量最高的[1]。蛋白质是一切生命体必不可少的组成部分, 胶原作为一大类蛋白质, 在生物体内起着重要作用。由于胶原蛋白有诸多优良性质, 使这类生物高分子化合物

用途非常广泛, 遍及医药、化工、食品等领域[2]。胶原蛋白具有巨大的开发潜力和利用价值。随着科学技术的发展, 人们对胶原的应用越来越广泛, 对胶原蛋白的需求越来越大, 如何既经济又快速获得胶原蛋白已成为人们关注的课题。

<一>实验材料介绍

广州管圆线虫病( Angiostrongyliasis) 是由广州管圆线虫( Angiostrongylus cantonensis) 幼虫寄生于人体中枢神经系统而引发的疾病。人感染广州管圆线虫后, 幼虫在人体内移行, 侵犯中枢神经系统, 引起脑组织病变。患者出现嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎。临床症状主要为急性剧烈头痛; 其次为恶心、呕吐、发热及颈项强直; 严重病例可有瘫痪、嗜睡、昏迷, 甚至死亡作为一种新发传染病的病原, 广州管圆线虫的许多生物学特性, 特别是分子生物学方面, 还未被人们所认知。鉴于广州管圆线虫在人体的感染和致病阶段主要为幼虫, 本实验根据广州管圆线虫幼虫的cDNA 文库表达序列标签( expression sequence tag, EST) 测序结果, 采用PCR 技术克隆并鉴定了广州管圆线虫胶原蛋白( collagen, COL) 基因的全长cDNA 序列, 并构建了其原核表达重组质粒, 为下一步的深入研究奠定了基础。

二．胶原蛋白的提取

1.1 实验原料

广州光源线虫

1.2 仪器设备

Beckman LG10 - 2.4A 冷冻离心机; Unico UV-2102 紫外分光光度计; ALPH AL- 2 冻干机; DYY-Ⅲ电泳仪:; 自动定氮仪:KTJELTEC, Auto1030 Analyzer; 835- 50 型氨基酸分析仪:; WR- 2001 溶剂过滤器:

1.3 试剂材料

胃蛋白酶、胰酶:,三氯乙酸, 对二甲氨基苯甲醛, 氯氨T, 高氯酸, 巯基乙醇, 柠檬酸缓冲液等。所有试剂均为分析纯;超滤膜: TS- 100, CXA- 50,

实验方法

1.4.1 酶法提取胶原蛋白本实验选用胰酶、胃蛋白酶进行酶解, 提取管园线虫的胶原蛋白。按原料∶缓冲液(pH8~9)1∶3 匀浆, 加入胰酶搅拌均匀, 在45℃酶解4h, 沸水浴灭酶

10min,5000r/min 离心15min, 取上清液, 将上清液冷冻干燥保存。去脂去杂蛋白的线虫, 按原料∶缓冲液(pH2)1∶7 匀浆, 加入胃蛋白酶搅拌均匀, 在37℃酶解6h,沸水浴灭酶10min, 7000r/min 离心15min, 取上清液, 将上清液冷冻干燥保存。

补充：酶法提取胶原蛋白具体原理

胶原蛋白是由三股螺旋组成的, 分子量在30 万u,每条肽链的分子量大约为10 万u。因胶原蛋白酶对胶原蛋白的水解主要破坏胶原的螺旋区, 使胶原蛋白水解为小分子肽类及游离氨基

酸, 而其他蛋白酶对胶原蛋白的酶解促溶, 只是切除胶原蛋白的尾肽,使其变为可溶[4], 所以用胃蛋白酶促溶的胶原蛋白溶液, 同原胶原具有相同的形状、大小及氨基酸组成,同酸溶性胶原蛋白在性质上无显著不同[5], 胃蛋白酶水解胶原蛋白是在37℃, 胶原蛋白没有变性[6], 从图1 第4 泳道的谱带可确定所提出的胶原蛋白为天然的、未变性的大分子胶原蛋白。

胃蛋白酶提出的胶原蛋白粗品分子量在7.8×104～9.9×104u 范围内, 如图1 所示, 说明样品的结构保持了肽链的完整性。然而, 当胃蛋白酶提取物被截留值为10 万的超滤膜分离之后, 样品却被分解, 形成了小分子量片段, 反而破坏了胃蛋白酶提取的胶原蛋白的结构。从被分离的两组分样品的分子量测定结果可以看出胃蛋白酶提取物无法被超滤膜完全分离。这可能因为胃蛋白酶提取物的冻干粉溶解于pH2 的缓冲液中, 形成了十分黏稠的液体, 无法穿透超滤膜,不利于超滤; 并且胃蛋白酶提取的胶原蛋白粗品从电泳图谱来看分子量相差不大, 因此, 用胃蛋白酶提取的胶原蛋白不需再进一步分离。根据电泳结果, 胰酶提取得到的胶原蛋白样品分子量分布在3.2×104～5.1×104 u 之间, 说明胰酶的水解力较强, 已经把胶原蛋白水解为小分子片段。分别用截留值为10 万和5 万的超滤膜进行分离, 不同组分收集到的产物用SDS- PAGE 电泳测得的分子量结果相近, 都在2～3 万u 之间。

三．胶原蛋白中氨基酸组成及含量

氨基酸组成分析

表2 胶原蛋白中氨基酸组成及含量

氨基酸名称Sigma 标准蛋白

含量/%aa 个数胶原蛋白(胰酶提胶原蛋白(胃酶提取)含量/%aa 个数取)含量/%aa 个数

Asp 3.61 4.78 7.39 6.25 6.28 5.43

Thr 1.25 1.66 1.94 1.84 1.88 1.82

Ser 1.2 2.01 2.32 2.48 2.48 2.72

Glu 6.74 9.06 12.39 9.65 11.51 9.00

Pro 9.01 13.78 15.11 14.78 16.28 16.30

Gly 11.14 26.10 19.76 29.63 16.41 24.73

Ala 5.97 11.80 8.84 11.17 9.53 12.30

Val 1.87 2.80 3.36 3.23 3.24 3.18

Met 0.54 0.64 1.18 0.85 1.01 0.78

Ile 0.93 1.24 1.93 1.66 1.40 1.22

Leu 2.04 2.73 3.53 3.02 3.51 3.07

Tyr 0.17 0.16 1.48 0.92 0.73 0.47

Phe 1.42 1.51 2.68 1.82 2.51 1.74

Lys 2.43 2.92 3.85 2.97 4.26 3.35

His 0.46 0.52 1.33 0.96 0.89 0.66

Arg 4.80 4.84 3.17 2.02 8.73 5.76

Hyp 6.45 8.66 8.49 6.78 8.51 7.47

合计60.03 100 98.72 100 98.89 100 用酶法提取出的胶原蛋白其氨基酸组成和含量与Sigma 胶原蛋白标准品比较, 结果如

表2 所示。对表2 的数据进行分析可以看出, 在用胰酶和胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中, 甘

氨酸的含量分别19.76和16.41%, 而sigma 胶原蛋白标准品中甘氨酸的含量是11.14%。胶原蛋

白I 是由两条α1(I)和一条α2 组合而成的三股螺旋, 一级结构表明, α肽链的96% 都是按

三联体的重复顺序(Gly- x- y)n 排列而成的, Gly 数目占残基总数的1/3[1]。表2 的数据显示,

胰酶和胃蛋白酶提取出的胶原蛋白中每100 个氨基酸中Gly 的残基数分别为29.63 和24.73 个, 而Sigma胶原蛋白标准品中甘氨酸的残基数为26.10 个。Sigma 胶原蛋白标准品中氨基

酸的总量仅占60.03%,其余为一些盐类杂质, 这从SDS- PAGE 的电泳图谱中也得到了验证,

但在它的蛋白组成中, 胶原蛋白的含量占95%, 达到了较高的纯度。本实验用胰酶和胃蛋白

酶提取出的胶原蛋白中, 蛋白含量分别为98.72%和98.89%, 蛋白含量都高于sigma 胶原蛋

白标准品, 但纯度略低, 分别为81%和84%。若经过适当的纯化处理, 可提高其纯度。如本实

验中用胰酶提取的胶原蛋白用截留值为5 万的超滤膜分离,在滤过组分的蛋白中胶原蛋白的

含量87%。

四．胶原蛋白全长cDNA 的克隆及PCR扩增

1.材料

1.1 文库广州管圆线虫幼虫的cDNA 文库由本室用CLONTECH的SMARTTM cDNA 文库构

建试剂盒构建, 文库的初始滴度为2.19 ×106 pfu /ml[ 3] 。

1.2 菌株与质粒大肠埃希菌( Escherichia coli, E.coli)DH5α株和BL21 株、原核表达质粒

pET32a ( +) 为本室保存; pMD18- T 载体购于大连宝生物工程有限公司。

1.3 主要试剂限制性内切酶为MBI 公司产品; T4DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP 为

大连宝生物工程有限公司产品; 琼脂糖、胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司产品; 其余

试剂为国产分析纯。测序由上海英骏生物技术有限公司完成。PCR 反应引物由上海生工生

物工程技术服务有限公司合成。

2. 方法

2.1 EST 分析通过NCBI 数据库( http: / / /BLAST/ ) Blastn, Blastx