高效液相色谱的原理

但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱
后馏分收集器。
制备HPLC概述—制备HPLC与
目的 填料 流量 样品中特定 成分的高纯 20μ以上 制备HPLC 度获取，大 为佳 量、廉价的 制备 定性分析： 检测的灵敏 度、重现性 3-5μ 分析HPLC 定量分析： 分离度、再 现性
分析HPLＣ比较
流通池 联系 在进行制 备HPLC 之前，常 先进行分 析HPLC 实验，对 分析方法 进行优化、 放大应用 到制备 HPLC中， 详见后。
液相色谱仪的组成
淋洗液 色谱柱 检测器 数据处理
液相色谱仪的组成
液相色谱仪的输液泵
输 液 泵 的 概 述
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻 力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它 是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵 、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部 件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定 ，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求 。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一 定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无 关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统 阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。目前 恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注 射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
高效液相色谱的原理
化学分析中的二个概念
化学分析的目的：
1.要确定被分析物是什么性质，即给物质定性。
2.要确定被分析物中每个组份的含量的大小，即给物质定量
定性分析
定量分析
色谱仪器的三个要素
1.分得开
对被分析的样品中的各组分要有良好的分离。 2.测得出 对被分离出的组分，不管其浓度大小均能识别 3.重现性好
对同一样品的多次检测数据均要一致。
色谱分离的三个要素
气相色谱 1.色谱柱 2.温度 液相色谱 1.色谱柱 2.液体的组成 3.液体的流量
3.气体的流量
液相色谱基础
常见的分离方式
化学物质成分的定性和定量分析离不开分离，我们常见 的分离方式有以下几种：蒸馏、离心、电泳、过滤、色谱等 ，其中色谱分离是最重要和有效的手段。 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的 各组分经过固定相(stationary phase)时，由于与固定相发 生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流 出。又称为色层法、层析法。
内径20～50mm，柱长50cm ～ 100cm。
检测部:通常使用紫外检测器
紫外检测器的结构与分析型一样，但流过池采用短光程的
馏分部:馏分收集器
有手动和自动之分
制备HPLC概述—制备泵的耐压
制备HPLC系统因制备柱的填料很细，
分离度好，同时反压很高，整个系统对压
力很敏感，制备泵要求能在制定的恒流量
5×104/m理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱103 块/m理论塔板数的柱效。
（3）选择性高 由于液相色谱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择 性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及其同 分异构体，还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体。
（4）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如广泛 使用的紫外检测器，最小检出量可达10-9g，用于痕量分析的荧光检测器，最
制备HPLC概述—应用举例：低浓度制备
在许多分离工作中，需要从大量的物质 中分离纯化不足１％的所需成分，这种分离
工作十分困难，在纯化的最后阶段常需使用
１０μ m或更小颗粒的高效填料。为获得所
需微量组分，可采用如下步骤：
制备型分离~半制备型分离~分析型分离~产物
制备HPLC技术问题—超量载样
在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。 样品量和固定相之比有的甚至小于1：100000，进样体积 一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1：100)。在这种 条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。 而在制备液相中，最大的区别就是超量进样。
所以LC只能用高压输液泵作为流动相的动力。
5.LC的样品回收比较容易，且可规模制备；GC的样品大部分会被破坏。 6.决定GC分离好坏的主要操作条件是固定相、流动相流速和柱温； 决定LC分离好坏的主要 操作条件是固定相、流动相流速和流动 相的组成。 7.在对付复杂样品方面，GC可采用柱温程序升温办法进行组份的分离；LC则采用梯度洗脱 的办法。
液相色谱仪的检测器
紫 外 检 测 器 UV-DETECTOR
液相色谱仪的检测器
紫
原
外
检
测
器
理：基于被分析组分对特定波长紫外光的
选择性吸收
定量基础：比耳定律，A＝KCL 优 点：1）对温度和流速不敏感 2）可用于梯度洗提 缺 点：仅适用于测定有紫外吸收的物质
制备HPLC概 述
• 制备型液相色谱：结构与分析型一样，
苯基
酚基 醚基 二醇基 芳硝基 腈基 胺基
二甲胺 基
反相
反相或正相 正相或反相 正相或反相 正相（反相） 正相（反相、 阴离子交换 正相、阴离子 交换 正相、阴离子 交换
中等极性化合物，保留极性相似于C8固定相，但对多环芳烃、极性芳香 族化合物、脂肪酸等具有不同的选择性 醚基具有斥电子基团，适用于分离酚类、芳硝基化合物，其保留行为比 C18更强（K’）增大 二醇基团比未改性的硅胶具有更弱的极性，易用水润湿，适于分离有机 酸及其齐聚物，还可作为分离肽、蛋白质的凝胶过滤色谱固定相 分离具有双键的化合物，如芳香族化合物多环芳烃 正相相似于硅胶吸附剂，为氢键接受体，适于分析极性化合物，溶质保 留值比硅胶柱低，反相可提供与C8、C18，苯基柱不同的选择性
下, 克服100 - 150 bars反压，总而言之，
制备泵的各项技术指标除流量外，都比分
析泵要低得多。
制备HPLC概述—柱容量
色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进 样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的 最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅 速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降 一半或容量因子k降低10%为宜。
正相可分离极性化合物，如芳胺取代物，脂类，甾类化合物，氯代农药；反相 分离单糖、双糖等碳水化合物；阴离子交换可分离酚、有机羧酸和核苷酸
正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离弱有机酸 正相相似于胺基柱的分离性能；阴离子交换可分离有机酸
二胺基
液相色谱法的特点
（1）适用范围广 已知有机物中仅 20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机 物可用HPLC分析。HPLC 适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不 稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。 （2）分离效能高 由于新型高效微粒固定相的使用，液相色谱填充柱的柱效可达2×103～
液相色谱仪的结构
高效液相色谱法与经气相色谱法的比较
以流动相来进行分类的
流动相 色谱类型
气体
液体
气相色谱（GC）
液相色谱（LC）
液相色谱仪的结构
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
流动相方面：
液相色谱
（1）液体流动相可为离子型、极性、弱极性、非极性溶液。 （2）液体流动相不仅起运载样品的作用，同时对样品组份有一定的亲和力（排阻色谱除外） 它会与固定相展开对组份的剧烈竞争，可与被分析样品产生相互作用，并能改善分离的 选择性。因而对分离起很大的作用。 （3）液体流动相动力粘度为10-3Pa· s，输送流动相压力高达2～20MPa。
液相色谱仪的结构
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
应用范围方面
液相色谱：
可分析低分子量低沸点样品；高沸点、中分子、高分子有机化合物（包括非极性、极性） 离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性的生物分子。总而言之，只要用合适的溶剂 溶解的物质，无论哪种都可成为LC分析的对象。 气相色谱： GC适合于分析那些在实验柱温下具有足够的挥发度且热稳定的物质，如分析低分子量、 低沸点有机化合物；永久性气体；配合程序升温可分析高沸点有机化合物；配合裂解技 术可分析高聚物。
液相色谱仪的结构
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
仪器的组成方面
液相色谱：
溶质在液相中的扩散系数（10－5cm2/s）很小，因此在色谱柱以外的死空间应尽量小，以 减少柱外效应对分离效果的影响。
气相色谱：
溶质在气相中的扩散系数（10－1cm2/s）大，在使用填充色谱柱时，柱外效应的影响较小， 但是对于毛细管色谱柱也要尽量减少柱外效应对分离效果的影响。
液相色谱仪的结构
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
操作条件方面
1.柱温：LC一般在室温下操作，而GC须根据样品设置色谱柱温度。
2.LC流动相的流速比GC流动相的流速慢1个数量级以上。 3.液体的粘度比气体大100倍，密度大1000倍，所以LC有很高的柱前压力。 4.气体可以压缩，GC用压缩后的气体的受控的释放作为流动相的动力；但是液体不能压缩，
气相色谱
（1）分离机理：依据吸附、分配两种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类较多。 （2）色谱柱：固定相粒度大0.1～0.5mm；柱内径为1～4mm，柱长1～4m，柱效为102 ～ 103 毛细管柱内径为0.1～0.3mm，柱长10～100m，柱效为103 ～ 104 ；柱温为常温～300℃。
液相色谱仪的结构
气相色谱
（1）气体流动相为惰性气体，不与被分析的样品发生相互作用，它仅起运载样品的作用， 一般对分离结果好坏没有影响。 （2）气体流动相动力粘度为10-5Pa· s，输送流动相压力仅为0.1～0.5MPa
液相色谱仪的结构
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
固定相方面：
液相色谱
（1）分离机理：可依据吸附、分配、筛析、离子交换、亲和等多种原理进行样品的分离， 可供选用的固定相种类繁多。 （2）色谱柱：固定相粒度小为5～10um；填充柱内径3～6mm；柱效为103 ～ 104 ，柱温为 常温。
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
检测器方面：
液相色谱 （1）选择性检测器：紫外可见检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、电化学检测器 激光诱导荧光检测器。 （2）通用型检测器：蒸发激光散射检测器、折光示差检测器
气相色谱
（1）选择性检测器：电子捕获检测器、氮磷检测器、火焰光度检测器 （2）通用型检测器：热导检测器、火焰离子化检测器
制备HPLC概述—分离效能
取决于分离速度、分辨率和上样量。对某一个分离参数 进行优化常会影响到其他分离参数。
分辨率
速度
载样 量
增加洗脱液流速会降 低分辨率，分辨率也 会因上样量过大而下 降。但分辨能力并不 总是制备HPLC首要考 虑的因素，制备型 HPLC应首先具有经济、 快速的生产所需产品 的能力。
小检出量可达10-12g。
液相色谱法的特点
（5）分析速度快 由于高压泵的使用，相对于经典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短 当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需 几分钟到几十分钟。 （6）独特的检测器 可在液相色谱中使用的检测器有可见紫外吸收检测器、二极管阵列检测 器、荧光检测器、示差折光检测器、电导检测器、脉冲安培检测器以及 近年来发展起来的蒸发激光散射检测器和激光诱导荧光检测器。且常用 的检测器都不破坏样品。 （7）样品易回收 液相色谱的常用检测器都不破坏样品，由于这个优点，样品被分析后， 在大多数的情况下，可以除去流动相，实现了色谱纯物质的回收。 色谱仪。
液相色谱柱的分类
键合相色谱的类型及其应用范围
类 型
烷基
性 质
非极性 非极性 弱极性 弱极性 弱极性 弱极性 极性 极性 极性 极性
色谱分Baidu Nhomakorabea方式
反相、离子对 反相、离子对
应
用
范
围
中等极性化合物，溶于水的高极性化合物，如：小肽、蛋白质、甾族化 合物（类固醇）、核碱、核苷酸、极性合成药物等
非极性至中等极性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烃、酯类（邻苯二甲 酸酯）、脂溶性维生素、甾族化合物（类固醇）、PTH衍生花氨基酸
0.1最大允许流 1000ml/mi 速可为 n 1000mL/mi n 一般的分析 池的最大允 0.0019.999ml/m 许流速仅为 5 mL/min， in 或者 10mL/min
制备HPLC概述—主要结构单元
输液部:输液泵
流量40mL/分～1000mL/分(从分析-半制备～生产型制备)
分离部:制备柱