蛋白质的分离纯化ppt课件

质 ►每一个蛋白质分子都因为结合了许多
的 纯 化 方 法
的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白 质分子原有的电荷则可以忽略。该法 主要利用了蛋白质分子量大小不同而 分离蛋白质。
►用已知分子量的蛋白质作为标准，则
可以估算出不同蛋白质的分子量。
等电聚焦
►将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7)
同蛋白质样品一起加入到已经灌好
►亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳方法测定。
也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 ► 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 ► 常用分子筛：
葡聚糖凝胶（Sephadex）
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
塑料离心 管
大分
子
4%
量
由
8%
小
12 蔗糖浓度
%16 %
—————
%20
% 蔗糖密度梯度
（介质还可用：氯化铯、甘油等）
电泳法
► 类型：பைடு நூலகம்、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、
细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅
胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白 质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分 子量的大小成正比变化。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
► 由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质 比，并具有相似的构象，因而有如下公式：
lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
► 实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对 数值对其μR作图，根据样品的μR值，从标准曲线 上就可查出其分子量。
► 注意事项：1、时间相对长对分离有利； 2、也可用来测定蛋白质的等电点。
等电聚焦（ Isoelectric focusing
）
等电聚焦（ Isoelectric focusing
）
离子交换层析
► 可分为阳离子交换---与阴离子交换---。 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小； 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。
蛋白质的分离纯化
► （一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离
► （二）粗分级 ► （三）细分级 ► （四）结晶
蛋白质的分离方法
► 根据蛋白质的溶解度差异分离 —沉淀技术 ► 根据蛋白质分子大小的差异分离 ► 根据蛋白质的荷电差异分离 ► 根据蛋白质与某些物质的吸附差异—吸附分离 ► 利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析
孔径大，用于分离大分子物质
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
凝胶层析
► 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗 脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子 物质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
密度梯度离心
滴加样 品
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
等电聚焦（ Isoelectric focusing
）
(1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。
(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。
(3)载体两性电解质：
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不 能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、 5.0-10.0。
用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或
蛋 聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的
白 内部是多孔的网状结构。
质 的
►Sephadex G10-G200(葡聚糖凝胶)
纯 ►Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶)
化 方
►Sephacryl S100,S200,S300,S400
法
(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶)
分子筛层析的工作原理
蛋白质分子量的测定
► 渗透压法
蛋白质分子量的测定
► 超离心法
蛋白质分子量的测定
► 凝胶过滤法 经验公式：lgM=K1-K2Ve（ K1、K2为常数） 用几种已知蛋白质，测其Ve，再对lgM作图得标
准曲线。再测定未知蛋白质的Ve，可得M。
蛋白质分子量的测定
► SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 lgM=K1—K2μR
泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。 2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。
垂直板电泳
垂直板电泳
垂直板电泳
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
► 蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电 荷以及分子大小和形状等因素。
► 加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇， 则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而 与原来所带电荷、分子形状无关。
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
蛋白质含量的测定
► 凯氏定氮法 ► Folin-酚试剂反应 ► 紫外吸收法 ► 考马斯亮蓝法 ► 双缩脲反应
蛋
白
质 的 纯 化
►在外加电场作用下，带电的蛋白质颗 粒在电场中移动的速度（v）取决于 电场强度(E)，所带的净电荷(q)，蛋
方 白质的分子量、分子形状以及与介质
测定沉降系数和扩散系数。 ► 溶解度恒定法
加入样品量为横坐标，样品溶解量为纵坐标， 作图。如只有一个拐点则说明样品纯。
蛋白质分子量的测定
► 最小分子量测定法 如Mb含Fe为0.335%，则 M=55.8/0.335%=16700。这就是最小分子量。 其实，真实分子量是最小分子量的n倍，n指Fe
的数目，Mb的n=1，所以M=16700；而Hb用其他方法 测得分子量为68000，则说Hb含4个Fe原子。
纯 ► 带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而
化 带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。
方 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液
法 进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，
可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。
离子交换层析法
蛋 白 质 的 纯 化 方 法
凝胶过滤法
►此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所
蛋白质的分离方法
► 可逆沉淀： 等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀
► 不可逆沉淀： 热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀
透析——只用于除盐类和小分子杂质
透析——只用于除盐类和小分子杂质
超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质
加 压
蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板
超滤液
凝胶层析
► 又叫分子筛层析。 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，
蛋 白 质
的凝胶中，在电场下，两性电解质 首先达到它的等电点而平衡，蛋白
的 质样品根据它自身的等电点分别向
纯 化
两极移动，最后也达到平衡。
方 ►等电聚焦：这种按等电点的大小，生物
法 分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚
焦的行为称等电聚焦。
► 等电聚焦的特点就 在于它利用了一种 称为两性电解质载 体的物质在电场中 构成连续的pH梯度， 使蛋白质或其他具 有两性电解质性质 的样品进行聚焦， 从而达到分离、测 定和鉴定的目的。
b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
等电聚焦（ Isoelectric focusing
）
► 通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形 成了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解 质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷， 并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。 即：pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解 质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处，结束。
法 的摩擦系数(f)。
几种常用的电泳
►纸电泳 ►醋酸纤维薄膜电泳 ►聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)
(可分为圆盘电泳和垂直平板电泳） ►琼脂糖凝胶电泳 ►SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ►等电聚焦(IEF) ►双向电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳法 电影
►聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用
聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法，
► SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和 疏水作用。巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分 子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的 侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一 个SDS分子。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
► 导致： 1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负
电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原 来的电荷差异。
— — Pr
通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱。
离子交换层析
离子交换层析
► 吸附本质：非共价连接 ► 常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶 ► 脱附方式：1、改变蛋白质带电状态；
2、改变环境溶液的pH、离子强度等。
离子交换层析
离子交换层析
离子交换层析
小结
► 粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级 等方法；
蛋 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰胺和
白 质 的
交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的多 孔网状凝胶。
纯 ►不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样
化 品胶。
方 法
►PAGE分辨率很高。
电泳过程
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
►SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离
子型表面活性剂，它能够与蛋白质多
蛋 肽链中的氨基酸残基按大约1 1.4比 白 例结合。
可以用适当的配体洗脱液洗脱。
亲和层析法
► 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋 白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼
蛋 脂糖凝胶等。 白 质 的 纯 化 方 法
蛋白质纯度等的测定
►纯度和分子量的测定：采用电泳 （如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子 筛层析、高速离心、高效液相色谱 等技术测定。
►等电点的测定：利用等电点时溶解 度最低或等电聚焦方法测定。
► 细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换 层析、吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可 采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步 骤。
蛋白质的纯度鉴定
► 各种细分级的方法都可以用于纯度鉴定 常用各种电泳法，比较权威的有：等速电泳、
梯度电泳、等电聚焦电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 ► 沉降分析和扩散分析
也叫凝胶过滤层析
亲和层析法
► 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理 是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的
蛋 特殊配基具有不同的识别和结合能力。 白 ► 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作 质 用的配基，然后应用化学方法将该配基与载 的 体共价连接。将这种连接有配基的载体装入 纯 层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过 化 层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结 方 合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流 法 出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，
蛋白质双向电泳
银染结果
考马斯亮染色为蓝色
连 续 电 泳
几种常用的层析法
►吸附层析 ►分配层析 ►离子交换层析 ►凝胶过滤层析 ►亲和层析
柱层析
离子交换层析法
► 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物， 将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。
蛋 白 质 的
► 离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素,如 羧甲基纤维素(CM纤维素）等，阴离子交换 纤维素,如二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）等。