小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取

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小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取

实验动物:6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠,小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤,或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。

试剂:75% 乙醇、RPMI 1640 (Gibcol/BRL,美国)、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml) 步骤:

1、取6周左右的小鼠,剃去腹部的毛并消毒。

2、引颈杀死动物,手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3~5秒。

3、倒立小鼠,置动物于解剖台上,固定四肢,75%酒精擦洗腹膜壁后,用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS 5mL注入腹腔中,同时从两侧用手指揉压腹膜壁,令液体在腹腔内充分流动。轻轻按摩腹部2-3分钟,静置5-7分钟。

4、无菌条件下,剪开腹壁,双手持镊撕开皮肤拉向两侧,暴露出腹膜,但勿伤及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。

5、用针头轻轻挑起腹壁,使动物体微倾向一侧,使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。小心拔出针头。把液体注入50ml离心管中。再用同样容量的PBS冲洗腹腔2~4次。合并渗出液于50 mL离心管中。直至冲洗液变澄清。

6、4℃250×g(1000 rpm/min)离心10min,去上清。

7、用PBS培养液洗涤细胞3次,每次4℃250×g(1000 rpm/min)离心10min,去上清。

8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。将调整细胞浓度调整至5×106 cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h,然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次,去除未贴壁的细胞,即得到纯化的贴壁巨噬细胞。

种96孔板。2h细胞贴壁。换液。墨汁(时间短,可以不灭菌)染色。观察。

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