固定化酶

中等
活力回收率
载体再生 费用 底物专一性 适用性
较高
可能 低 不变 酶源多
低
不可能 高 可变 较广
高
可能 低 不变 广泛
中等
不可能 中等 可变 较广
高
不可能 低 不变 小分子底物、 药用酶
3 评价固定化酶指标
固定化后酶的考察项目
（1） （3）
测定固定化酶的活力，以
确定固定化过程的活力回收 率。
考察固定化酶最适反应 条件。
固定化后酶性质的变化
4
固定化酶和亲和色谱
• 亲和技术的基础：是生物活性化合物生物特异信 息的综合。 • 利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、 高专一性，可逆结合而设计的纯化方法。 • 是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的 分离方法。
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固定化后酶性质的变化
2
• 固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物
固定化酶在医药治疗上的应用
青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
H2N R1
O
R2
+
NH2 O N O
S
Penicillin G acylase H2O R
1
OH
NH2 H N S O N O O OH
1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe
酶降低了酶的亲和力。
• （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km'<Km
6 固定化酶的应用
固定化后酶性质的变化
1
固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用 • 葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固 定化酶。 • 利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶 • 固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类 • 热点：固定化原生质体的应用
5
相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定 化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。
4 影响固定化酶性 质的因素
影响固定化酶性质的因素
1 2
酶本身的变化： 主要是由于活性中心的氨基酸 残基、高级结构和电荷状态等发生了变化 载体的影响 （1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应 固定化方法的影响
固定化后酶性质的变化
3
固定化酶在分析化学中应用
• 酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光
计或电量计结合，形成酶电极，进行
某些物质的自动分析。
固定化后酶性质的变化
酶电极
• 特点：快速、方便、灵敏、精确
• 范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、 脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等
• 要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。
2. 结合法
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团
共价键 结合法
• 然后活化该活泼基团 • 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共 价键

3.交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交联
交联 法
作用，制成网状结构的固定化酶的方法。也可用于 含酶菌体或菌体碎片的固定化。
固定化后酶性质的变化
固定化后酶稳定性提高的原因：
• a. 固定化后酶分子与载体多点连接。
• b. 酶活力的释放是缓慢的。
• c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
固定化后酶性质的变化
3
PH对酶活性的影响：
• （1） 改变酶的空间构象 • （2）影响酶的催化基团的解离
• （3）影响酶的结合基团的解离
• （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结 合 或结合后不能生成产物。
O
R1
NH2 H N S O N R3 O O OH
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
2 固定方法
固定化酶的方法
交联法
吸附法
主要 包括
包埋法
结合法
1. 吸附法
物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶 或含酶菌体吸附在其表面上。
吸附 法
选择载体的原则: -要有巨大的比表面积 -要有活泼的表面 -便于装柱进行连续反应 物理吸附法: -静止法 -电沉积法 -反应器上直接吸附法 -混合浴或振荡浴吸附法
固定化后酶性质的变化
pH对固定化酶的影响
• 1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
• 微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
固定化后酶性质的变化
• 2）载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 • 3）产物性质对体系pH的影响 • 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游 离酶的pH值高；反之则低。
4.包埋法
2．微囊型包埋法
将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制 成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有 几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
包埋 法
各类固定化方法的特点比较:
比较项目 吸附法 物理 难 强 离子键结合 易 交联法 包埋法
固定化酶
组员
海丹 201421141033 潘萌 201421141026 胡颖 201421141047
目录 CONTENTS
1 定义及特点 4
影响因素
2 5
固定方法
3 6
评价指标
酶性质变化
应用
1定义及特点
定义
什么是固定化酶？
● 将酶从微生物细胞中提
取出，将其用固定支持物
水溶性酶
1. 吸附法
优点：固定化时酶分子的构象很少
吸附 法
或基本不发生变化。
缺点：结合力弱，易解吸附。 载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
2. 结合法
概念：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。
• 第一个离子结合法固定化酶：
DEAE — Cellulose
离子键 结合法
固定化过氧化氢酶 • 第一个工业化的固定化酶：
固定化后酶性质的变化
4
最适温度变化
• 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 底物特异性变化
• 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 特 • 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 异性往往会变化。
5
固定化后酶性质的变化
6
米氏常数Km的变化 Km值随载体性质变化 • （1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化
（2）
考察固定化酶稳定性。
评价固定化酶的指标
1
固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的 酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位 表示（酶膜、酶管、酶板）。
2
操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活 力一半所需要的时间（t1/2）
评价固定化酶的指标
3 4
或称偶联效率，活力保留百分数。
水不溶性载体
固定化技术
（称为载体）固定，使其
成为不溶于水或不易散失 和可多次使用的生物催化
剂，这种固定的酶称为固
定化酶。
水不溶性酶 （固定化酶）
固定化酶特点
优点
@不溶于水，易于与
产物分离；
缺点
@ 固定化过程中往往会
引起酶的失活
@可反复使用； @可装塔连续化生产； @稳定性好。
@ 首次投入成本高
@大分子底物较困难
3
5 固定化后酶性质 的变化
固定化后酶性质的变化
1
固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降 原因：酶结构的变化、空间位阻
2
固定化对酶稳定性的影响 （1） （2） （3） （4） （5） 操作稳定性提高。 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 对热稳定性，大多数升高，有些 反而降低。 对分解酶的稳定性提高。 对变性剂的耐受力升高。
DEAE-Sephadex A-50
固定化氨基酰化酶
• 常用载体: DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 • 使用注意：pH、离子强度、温度
2. 结合法
共价键 结合法
（1）概念: 共价键结合法(共价偶联法)：通过共价键 将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团 进行偶联以制备固定化酶的方法 （2）可以形成共价键的基团： 游离氨基，游离 羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基， 吲哚基，二硫键 （3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
图 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶 性的固定化酶。
4.包埋法
定义：酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中使
包埋 法
酶固定化的方法。
分为：网格型和微囊型
4.包埋法
1．网格型
包埋 法
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成
一定形状的固定化酶的方法。也称为凝胶包埋法。
Ampicillin (RI = H) Amoxicillin (R1 = OH)
7-ACA as nucleus
固定化后酶性质的变化
2
固定化酶在医药治疗上的应用 青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
NH2 R2 R1 O H2N S N O R3 OH
+
Penicillin G acylase H2O
标题数字等都可以通过点击和重新输入进行更改，顶部“开始”面板中可以对字 体、字号、颜色、行距等进行修改。建议正文8-14号字，1.3倍字间距。标题数 字等都可以通过点击和重新输入进行更改，顶部“开始”面板中可以对字体、字 号、颜色、行距等进行修改。建议正文8-14号字，1.3倍字间距。
较难 强
较难 强
• 常用试剂:戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来
亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛。
3.交联法
双功能试剂：
常用的是戊二醛
交联 法
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛的两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱 (shiff)。
3.交联法
交联 法
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成