经典方法学详解

史上最全的方法学详解

题语:总结了方法学验证和质控的内容,及方法学验证中存在的可能的风险。

关键词：生物样品分析;方法学验证;方法学质控

311 特异性

特异性(Selectivity) 要求至少6 个不同个体的空白样品无干扰, 并要求提供空白生物样品色谱图、空白生物样品加对照物质色谱图、用药后的生物样品色谱图。如果采用内标方法,还需要提供空白生物样品加内标物质色谱图, 以证明内标中所含杂质不干扰待测药物的分析。

312 线性

31211 线性范围确定

根据生物样品中药物浓度范围, 确定线性范围。建立标准曲线时应随行空白生物样品, 但计算时不包括该点。标准曲线至少有不包括空白在内的6 个点。定量范围应能覆盖全部待测浓度, 不允许将定量范围外的浓度推算为未知样品的浓度。

31212 相关系数与反算浓度

通过系列浓度的标准生物样品进行测定, 得到浓度与响应值的回归方程。对于标准曲线的要求除相关系数( r) 值大于0.99 外,还要求经标准曲线反算浓度要在真实浓度的±15 %范围内, 标准曲线最高点和最低点在±20 %范围内。为保证生物分析数据的质量, 采用何种算法建立标准曲线尤为重要, 分析方法委员会(Analytical met hodscommit tee) 推荐使用加权回归方程检查标准曲线的线性(Linear range)。与普通最小二乘法不同的是加权最小二乘法(Weighted least squares) 在回归计算时增加了1 个权重因子W , 采用这种方法计算回归直线的斜率和截距, 可使生物样品的测定结果与理论值的相对偏差在不同的浓度区间内比较均衡[4 ]。对于测定浓度范围特别宽的少数情况下, 可采用不同浓度区间2 条回归直线组合的方法。

31213 标准曲线各个点的取舍

标准曲线的浓度范围和浓度点一经确定, 在每个分析批次(Batch) 中, 不能为了达到以上对于线性的要求而对标准曲线各个组成点作舍弃处理。只有当标准

曲线中某点的反算浓度超过真实浓度的15 % , 才能作舍弃处理, 并要保证舍弃后标准曲线至少包括6 个点。标准曲线最高点和最低点不能作舍弃。

31214 最低定量限(LLOQ)

定量下限是标准曲线的最低浓度点。LLOQ 的确定应该测定至少5 个样品(不包括标准曲线中的最低浓度点) , 保证在真实浓度的80 %～120 %内, 变异系数(CV) 不得超过20 % ,并且信噪比应大于5 。LLOQ 区别于检测限(Detection limit ) , 检测限只要求信噪比为3 。

313 精密度与准确度

31311 质控样品浓度确定

一般采用3 个浓度的质控样品,低浓度接近定量下限, 在定量下限的3 倍以内; 高浓度接近标准曲线的上限(一般为高浓度的80 %) ; 中间选择一个浓度, 每一浓度至少5 个样品。目前, 国际杂志上有些论文中质控样品浓度的选择为标准曲线的最低点、最高点和中间浓度。

31312 精密度(Precision)

用质控样品的批内和批间相对标准差( RSD) 表示, RSD 一般应小于15 % ,在LLOQ 及最高定量限(ULOQ) 附近RSD 应小于20 %。一日内每隔2 h 处理一组低、中、高浓度样品,共处理5 组,来计算日内精密度。获得批间(日间) 精密度应至少连续测定3 个分析批次,一般为5 个分析批次,每个浓度至少测定3 个样品。

31313 准确度(Accuracy)

指测定生物样品浓度与真实浓度的接近程度,用REC( %) 表示,一般要求应在85 %～115 %内,在LLOQ 及ULOQ 附近REC 应在80 %～120 %内。

314 稳定性

根据具体情况, 对分析过程中所涉及到的预处理前、预处理中及预处理后的样品在不同基质、不同放置条件下及不同存放时间进行稳定性(Stabilit y) 验证, 以排除外界因素对测定结果的影响, 保证分析结果的客观性。一般主要考察以下几个方面:

31411 贮备液(Stock solution ) 稳定性

验证贮备液在特定溶媒、特定保存温度下(一般2 个温度,室温和冷藏) 、不同放置时间的稳定性, 以确定贮备液的保存条件和保存日期。经过特定贮存条件的贮备液浓度与新配制的贮备液浓度的偏差( % ,Difference) 不超过5 %。偏差= (新配制贮备液峰面积—稳定性考察的贮备液峰面积) / 新配制贮备液峰面积×100 %。因为所测定的样品是溶媒中而非生物基质中, 故其可接受标准为5 %。31412 待测药物在生物样品中的稳定性

冷冻解融稳定性指制备好的质控样品经过 3 个循环的冷冻解融时的稳定性变化情况。质控样品冷冻保存24 h ,放置于室温,自然解融至室温,然后再冷冻12～24 h , 称为一个冷冻解融循环。短期放置稳定性指验证样品在生物介质中室温放置4～12 h 的稳定性, 一般采用室温4 h 。长期冷冻放置稳定性放置时间的设置根据实验中样品采集到样品分析的可能的时间间隔, 一般采用2 、4 、8周。31413 处理好样品(Processed samples) 稳定性

一般指处理好的样品置于自动进样器到进样时间段样品的稳定性。如果自动进样器不能进行温度控制, 一般考察处理好样品放置于室温24 h 的稳定性; 如果自动进样器可控制温度, 则考察设置温度下处理好样品24 h 的稳定性。在该项验证中需要注意的是,如采用内标法, 则内标的稳定性也需要同时进行考察。在稳定性考察中, 每项考察采用低、中、高3 个浓度样品, 每个样品平行操作3～5 份, 其可接受标准定为每个浓度中67 %的样品与真实浓度的偏差不超过15 %。偏差= (真实浓度—稳定性考察样品的测得浓度) / 真实浓度×100 %。

315 稀释

中国药房2008 年第19 卷第31 期China Pharmacy 2008 V ol . 19 No . 31 ·2471 ·超出线性范围的样品可采用稀释(Dilution) 的方法, 但是必须对该项进行验证,采用相同基质进行稀释,最少平行操作6份, 并保证67 %的样品稀释后的测定浓度在真实浓度的85 %～115 %内。

316 基质效应

按照美国临床实验室标准化委员会的定义, 基质效应(Mat rix effect ) 指样品中除目标分析物以外的其它成分对待测物测定值的影响, 即基质对分析方法准确测定分析物能力的干扰。在采用质谱方法进行体内药物定量检测时, 应进行基质