高效液相色谱原理

高效液相色谱法（HPLC）
一、方法原理
1、液相色谱法概述
高效液相色谱分析法
其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信
号送至数据处理系统记录、处理和保存。

HPLC仪器的基本结构
2、高效液相色谱法的特点（HPLC）
与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分
配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。

由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。

特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。

高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。

高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。

如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。

3、高效液相色谱法的固定相和流动相
（1）固定相
表面多孔型和全多孔型两大类。

（2）流动相（淋洗液）
流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。

从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：
①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。

②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱
性能的改变。

③与所用的检测器相匹配。

④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏
度。

⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱
效）和适当低的沸点。

⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人
员的安全。

液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。

4、高效液相色谱法的主要类型
（1）液—固吸附色谱法
①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。

②固定相：极性和非极性两种。

极性固定相：硅胶、氧化镁。

非极性固定相：多孔微粒活性炭、多孔石墨化炭黑。

③流动相：基本原则：极性大的试样用极性较强的流动性；极性小的试样用极性较低的流动性。

液—固吸附色谱法适用于分离具有中等相对分子质量的非极性或非离子型的油样品；分离异构体；但不适用于分离同系物。

（2）液—液分配色谱法
①分离原理：利用混合物中各组分在固定相和流动相中溶解度的差异来进行分离的。

②正相与反相液-液分配色谱：
正相液—液色谱分离：流动相的极性小于固定液的极性。

固定相为极性组分，流动相为非极性溶剂。

适用于极性组分的分离。

反相液—液色谱分离：流动相的极性大于固定液的极性。

固定相为非极性组分，流动相为极性溶剂。

适用于非极性组分的分离。

③固定相：固定液涂在载体上或微球吸附剂上。

④流动相
（3）凝胶色谱法（分子排阻色谱法）
根据所用流动相的不同，凝胶色谱法可分为两类：
凝胶过滤色谱法：（GFC）用水溶剂作流动相。

凝胶渗透色谱法：（GPC）用有机溶剂四氢呋喃。

凝胶色谱法主要用来分析高分子物质的分子量分布，以鉴定高分子聚合机理，选择聚合工艺及条件，并考察聚合材料在加工和使用过程中分子量的变化。

二、高效液相色谱仪
1、仪器基本构造
先做一个个单元组件，然后根据需要将各个单元组件组合起来。

最基本的组件是高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器和工作站（数据处理系统）。

可根据需要配置自动进样系统、预柱、流动相在线脱气装置和自动控制系统等。

下图是典型HPLC系统的结构示意图
（1）仪器工作流程：
高压输液泵将储液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。

（2） 流动相净化装置
A. 过滤：
原因是防止不溶物堵塞流路或色谱柱。

方法是用0.45μL以下微孔滤膜（有机溶剂或水）过滤。

B.脱气：
原因是溶解有氧气或混入了空气而形成气泡，会使色谱图上出现尖锐的噪声峰；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，致使基线起伏。

方法有超声波震荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、在线（真空）脱气。

目前广泛使用的是超声波震荡脱气。

其方法是将配好的流动相连同容器一起放入超声波水槽中脱气10~20min。

（3）高压输液系统
高压输液系统一般包括贮液器、高压输液泵、梯度洗脱装置等。

A.储液器：由玻璃、不锈钢或特种塑料制成。

B.高压输液泵：是高效液相色谱仪的关键部件。

其作用是将流动相以稳定的流速或压力送到色谱分离系统。

要求是压力平稳无脉动，流速稳定，流量可调节，泵体材料耐化学腐蚀，死体积小，一般要求有25~40MPa。

一般分为恒流泵★和恒压泵。

目前使用较多的是第一种。

C.过滤器：装置在高压输液泵的进口和它的出口与进样阀之间。

作用是防止微小的杂质进入流动相，导致活塞或阀芯损坏，不能正常工作。

D.梯度洗脱装置★：是指流动相梯度。

即指分离过程中改变流动
相的组成（溶剂极性、离子强度、pH 等）或改变流动相的浓度。

依据梯度装置所能提供的流路个数可分为：★二元梯度、三元梯度等。

依据混合的方式不同可分为：高压梯度和低压梯度。

梯度洗脱技术可改进复杂样品的分离，改善峰形，减少拖尾并缩短分析时间。

提高分离精度，降低最小检测限。

特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。

（4）进样系统：将样品溶液准确送入色谱柱的装置。

要求是密封性好、死体积小、重复性好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波动要很小。

进样器的作用是将样品溶液准确送入色谱柱上进行分离。

常用的进样器有以下两种。

1）六通阀进样器六通阀进样器的工作原理与气相色谱中的六通阀进样相似，进样体积由定量管确定，规格为10μL和20μL，结构如图7-17所示。

（a）取样（b）进样
图7-17 高效液相色谱仪六通阀进样器
2）自动进样器
自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按预先编制的注射样品操作程序进行工作。

取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的转动，全部按预定程序自动进行，一次可进行几十个或上百个样品的分析。

但此装置一次性投资很高，目前在国内尚未得到广泛应用。

进样器是六通阀进样器。

耐高压、重复性好、操作方便的特点。

（5）色谱柱★
液相色谱仪常用的色谱柱一般采用内壁抛光的不锈钢或塑料柱管。

标准的填充柱内径为4.6mm或3.9mm，柱子的长度一般为10～50cm，柱子的形
状一般采用直形柱，具有较高的柱效，易于在填充时保证填充均匀，装柱与换柱都比较方便。

此外，色谱柱在装填料之前是没有方向性的，但填充完毕的色谱柱是有方向的，即流动的方向应与柱的填充方向(装柱时填充液的流向)一致。

色谱柱的管外都以箭头显著地标了该柱的使用方向(而不像气相色谱那样，色谱柱两头标明接检测器或进样器)，安装和换色谱柱时一定要使流动相能按箭头所指方向流动。

★是整个色谱仪的心脏。

要求耐高压、流动相和样品的腐蚀。

一般用不锈钢制成。

色谱柱一般为直柱。

柱内径一般为2~5mm，柱长为15~50cm。

★预柱（保护柱）的作用是保护延长分析柱的寿命。

可以挡住流动相中的细小颗粒，以阻止其堵塞色谱柱。

可更换。

★恒温装置的作用是由于温度的微小波动可导致基线的起伏。

色谱柱在装料前没有方向性。

色谱柱在装料后就有方向性了。

即流动相的方向与柱的填充方向（装柱时填充液的方向）一致。

安装或更换时要按照箭头方向操作。

装柱是一项技巧性很强的工作，对分离效果影响很大。

有干法和湿法。

（6）检测器：连续监测被色谱分离后的柱流出物组成和含量的装置。

作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，完成定性定量分析。

高效液色谱仪检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，完成定性定量分析的任务。

其基本要求是：灵敏度高，重现性好，噪声低，对流动相温度及流量的变化不敏感，线性范围宽，适用范围广，响应时间足够快。

常用的检测器有紫外-可见光检测器、折光指数检测器及荧光检测器等。

A.紫外-可见光检测器（UV-Vies）
紫外-可见光检测器(UV—Vis)，又称紫外可见吸收检测器、紫外吸收检测器，或直接称为紫外检测器，是目前液相色谱中应用最广泛的检测器。

在各种检测器中，其使用率占70％左右，对占物质总数约80％的有紫外吸收的物质均有影响，既可检测190～350nm范围(紫外光区)的光吸收变化，也可向可见光范围甚至近红外光范围（400～850nm）延伸。

光源1(氘灯)发射的光经聚光透镜聚焦2，由可旋转组合滤光片3滤去杂散光，再通过入口狭缝4至平面反射镜5，经反射后到达光栅6，光栅将光衍射色散成不同波长的单色光。

当某一波长的单色光经平面反射镜5反射至光分束器7时，透过光分束器的光通过样品流通池，最终到达检测样品的测量光电二极管；被光分束器反射的光到达检测基线波动的参比光电二极管；比较样品和标准物质检测池，在固定波长下，其基本结构与一般紫外可见光分光光度计是相同的，均包括光源、分光系统、试样室和检测系统四大部分，如图7-18所示。

唯一不同的是部件是流通池。

一般标准池体积为5～8μL，光程长为5～10 mm，内径小于1 mm，结构常采用H型，如图7-19所示。

参比光电二极管的信号差，此即为样品的检测信息。

这种可变波长紫外吸收检测器的设计使它在某一时刻只能采集某一特定的单色波长的吸收信号。

光栅的偏转可由预先编制的采集信号程序加以控制，以便于采集某一特定波长的吸收信号，并可使色谱分离过程洗脱出的每个组分峰都获得最灵敏的检测。

紫外-可见光检测器可输出的吸收信号（即吸光度A）与该样品浓度成正比，这就是紫外-可见光检测器的工作原理。

图7-19 紫外检测器流通池图 图7-18 紫外-可见光检测器光学系统图
B. 折光指数检测器（RID ）
折光指数检测器(RID)，又称示差折光检测器，是一种通用型检测器。

它是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定试样浓度的检测器。

按物理原理，折光指数检测器一般可分为：反射式、偏转式、干涉式和克里斯琴效应示查折光检测器。

通常HPLC 都使用反射式，因其池体积很小(一般为5μL 左右)，可获得较高灵敏度，如图7-20所示显示了这种检测器的光路示意图。

由钨丝光源SL 发射出的光经遮光板M 1，经红外滤光片F ，遮光板M 2后，形
成两束能量相同的平行光，再经透镜L 1分别聚焦至测量池和参比池上。

透过空
气-三棱镜界面、三棱镜-液体界面的平行光，由池底镜面折射后再反射出来，再经透镜L 2聚焦在光敏电阻D 上，将光信号转变成电信号。

信号经放大后，送
入记录仪或微处理机绘制出色谱图。

此检测器就是通过测定经流动相折射后反1一流通池；2一测量擘；3一参比擘；4一入射光；5一出射光 1一光源；2一聚光透镜；3一滤光片；4一入口狭缝；5
一平面反射镜；6一光栅；7一光分束器；8一参比光电二极管；9一流通池；10一样品光电二极管
射光的强度变化来检测试样中组分的浓度的。

★折光指数检测器的普及程度仅次于紫外检测器，属于总体性能检测器，它对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能够检测。

折光指数检测器还适用于流动相紫外吸收本底大，不适于紫外吸收检测的体系。

在凝胶色谱中折光指数检测器是必不可少的，尤其是对聚合物，如聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布的测定。

此外折光指数检测器在制备色谱中也经常使用。

（7） 数据处理系统：记录仪、色谱数据处理机和色谱工作站。

其作用是记录和处理色谱分析的数据。

高效液相色谱仪现已广泛使用色谱数据工作站来记录和处理色谱分析数据并进行仪器的操作与控制，在使用时可根据具体软件的有关说明或指导书进行操作。

图7-20 反射式折光指数检测器的光路图。