狂犬疫苗

狂犬疫苗研究进展

石家庄学院化工学院12级生物工程杨申雨20120702039

摘要：狂犬病是感染中枢神经系统的一种人兽共患的急性接触性传染病，由狂犬病痛毒(Rabies Vi—rus，RV)引起，病毒粒子聚集形成胞浆内包含体，只在神经细胞胞浆和蒲肯野氏细胞里存在。RV可分成4个血清型和2个尚待定型的病毒株。随着RV血清型变异，目前人用和动物用狂犬病疫苗毒株已不能提供针对所有种类RV的有效保护，为了对狂犬病及其研究进展有一个全面的认识，该文主要对RV病原以及狂犬病疫苗等方面的研究进展进行了综述。

关键字：发现过程、化学结构、理化性质、接种对象、生产工艺、趋势展望

发明狂犬疫苗的是著名的法国生化学家路易斯•巴斯德。一开始，巴斯德将狂犬病毒注射到家兔的体内，让病毒经过传代，再注射到健康狗的体内，他发现：经过多次传代后，病毒的毒性大大降低。将这种病毒注射进健康狗的体内时，狗不仅不会发病，且能对狂犬病毒产生免疫力。这一动物实验取得成功后，巴斯德又将多次传代的狂犬病毒随兔脊髓一起取出，并进行自然干燥减毒。然后把这种脊髓研成乳化剂，用生理盐水稀释，制成了最早的兔脑基髓制备的减毒狂犬疫苗，并在治疗人的狂犬病时取得了成功。虽然现在科学技术不断发展，人类目前用得最多的是人用狂犬病纯化疫苗，巴斯德的疫苗早已不再使用，但是，巴斯德是第一个成功发明狂犬疫苗的人，并用他的疫苗拯救了很多狂犬病人。

一，目前，用于人和动物狂犬病预防主要使用的是常规疫苗，常规疫苗尽管安全有效，但存在一些缺点。随着分子病毒学和疫苗学的发展，研制安全、有效、经济、使用方便的狂犬病新型疫苗已成为当前开发的活跃领域。目前已经和正在研制开发的狂犬病新型疫苗主要有亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗、基因缺失疫苗、抗独特型疫苗、转基因植物可食疫苗等。下面就近年来国内外有关方面的研究进展进行综述。

1亚单位疫苗

亚单位疫苗可以分为化学亚单位疫苗和基因工程亚单位疫苗。狂犬病化学亚单位疫苗是从全病毒中提取病毒糖蛋白成分，Perrin P等[73通过正辛基一pD吡喃葡萄苷裂解狂犬病病毒糖蛋白，然后将糖蛋白嵌入脂质体，形成具有40 nm～70 nm 长的向外突起的颗粒状免疫体，接种动物后可诱生高水平的中和抗体，能够保护

动物对街毒的攻击。若将G蛋白包在脂质体内而不是嵌在表面，其免疫作用并无明显提高。用皂甙与G蛋白制备成免疫刺激复合物，不仅较氢氧化铝制成的G 蛋白亚单位疫苗免疫效果好，而且安全并能诱导细胞免疫。但是存在的问题是从完整病毒粒子中获取病毒的有效成份制备亚单位疫苗，抗原量有限，成本高，且提取困难，提取过程可能会破坏糖蛋白本身的空间构象而达不到预期免疫效果。在此基础上，还可将分离得到糖蛋白经溴化氢裂解，产生Crl、Cr2⋯Cr7等7个片段，其中有3个片段可以产生中和抗体，这种疫苗称之为多肽疫苗。亚单位疫苗和多肽疫苗，都是病毒颗粒上的一部分，都不含有病毒的基因成分，因此非常安全，但是它们的免疫原性较低，需要与佐剂或载体偶连应用[8]基因工程亚单位疫苗方面，Lafon等从CVS株克隆糖蛋白基因，切除糖蛋白cDNA的信号肽序列，经质粒pBR322转化大肠埃希菌形成菌落库。设计了不同长度糖蛋白的编码序列并构建了表达载体，转化大肠埃希菌后表达出多种蛋白。这些基因工程多肽虽然都不同程度与天然糖蛋白抗血清发生反应，但结合抗糖蛋白抗体的能力仅为糖蛋白的2％～3％，且免疫原性差。Lathe等用噬菌体M13作载体在大肠埃希菌中表达了狂犬病病毒的G蛋白抗原，此后又有许多人通过改造表达载体和大肠埃希菌的表达特性来表达狂犬病糖蛋白或膜外区或主要的抗原表位，但获得的免疫结果很差。试验证明G蛋白在大肠埃希中以变性形式存在，G蛋白诱导机体的免疫应答严格依赖于完整的二级和三级结构。Klepfer S R等将SAD株全长GP 基因亚克隆带进启动子的酵母表达质粒，利用酵母表达系统表达狂犬病病毒糖蛋白。利用酵母表达系统，表达的糖蛋白量很大，也能进行糖基化修饰，但糖基化位置和糖基化的类型会与天然蛋白存在差异，而影响其免疫原性，因此此种方法制备狂犬病病毒亚单位疫苗效果有限。现已成功的用真核表达系统表达了狂犬病病毒G蛋白和N蛋白，加佐剂后接种动物可诱导对狂犬病病毒的免疫，可有效诱导小鼠产生对狂犬病病毒的细胞免疫和体液免疫，并抵抗致死剂量犬病街毒的攻击。但是哺乳动物细胞表达的亚单位疫苗，生产工艺复杂、耗时、成本高，而且表达水平偏低，因此限制了它的研究应用。Fu Z F等【9]将杆状病毒表达的糖蛋白纯化后免疫动物，研究表明，杆状病毒表达的狂犬病病毒糖蛋白经口服免疫接种，诱导浣熊产生了中和抗体，并能抵抗狂犬病强毒株的攻击。

2合成肽疫苗

目前关于狂犬病合成肽疫苗的研究，包括了大部分糖蛋白的主要抗原表位区，合成的多肽有6个～36个氨基酸残基。但免疫小鼠后中和抗体水平不高。新一代的合成肽疫苗由狂犬病病毒T细胞表位和糖蛋白中和性表位组成，但体内多次免疫不会产生高水平抗体，但一旦机体受病毒攻击，就有初次免疫效应和一定的免疫保护作用口们。目前合成肽疫苗离实际应用的差距还较大，但研究前景较为广泛。

3 DNA疫苗

DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制之下，构成重组质粒DNA，将其直接导入动物机体内，通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。基因疫苗能诱导产生细胞和体液免疫，能够刺激产生较强和较持久的免疫应答，可以将含有不同抗原基因的质粒混合起来进行联合免疫，可以反复使用，因此基因疫苗成为新型疫苗发展的热点。在狂犬病基因疫苗研究方面，1994年Wistar 研究所Xiang Z Q等[11]将编码狂犬病病毒糖蛋白的cDNA插入sV40启动子下游，构建狂犬病病毒的DNA疫苗，直接注射小鼠腓肠肌，免疫3次，间隔2万方数据70 动物医学进展2007年第28卷第12期(总第172期)周～3周，每次150弘g。免疫后小鼠产生了抗狂犬病病毒中和抗体、抗狂犬病病毒糖蛋白特异性CTL 和分泌淋巴因子的Th细胞，用5倍LD5。剂量的狂犬病病毒CVS株攻击，均获得保护，而对照组小鼠14 d内全部死亡。Lodmell D L等[123把带有G基因的DNA 包被在2．6肛m金粒上，用基因枪免疫小鼠，初免及加强免疫后均可检测高滴度的抗体，并持续300 d，315 d后用致死量的狂犬病病毒攻击，小鼠全部存活。Ray N B等用单磷脂质A作为免疫刺激物，皮下免疫小鼠，可以提高DNA疫苗的免疫应答a LodmeU D L等用MPL作DNA疫苗的佐剂，比较了不同途径的免疫接种，发现用MPL初次免疫的小鼠，皮下及肌肉接种，中和抗体的滴度明显高于无佐剂的DNA疫苗，加强免疫后，未用佐剂组高于用佐荆组、基因枪免疫组，其抗体滴度继续升高。Xiang Z Q等用鼠粒细胞噬菌体集落刺激因子与狂犬病病毒DNA疫苗共同免疫，可提高体液免疫和细胞免疫应答水平。在我国，扈荣良等[13]首先将狂犬病病毒糖蛋白G基因插入PMT010／A+表达载体中，肌肉免疫小鼠后，能产生抗狂犬病病毒的抗体，对狂犬病病毒强毒攻击有一定的保护作用。李萍等