高效液相HPLC常见故障分析及其排除方法
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检测池有气泡 噪声尖大
接地线 噪声大
压力过大 噪声大
参比池污染 噪声大
检测池漏液 噪声大
您的检测器噪声如何?
13
2020/5/26
紫外可见分光光度分析
紫外光源的获得
2020/5/26
紫外可见分光光度分析
紫外分光光度计介绍
比例双光束分光光度计
滤光片 氘灯
步进电机
准直镜
入狭缝 平面光栅
出狭缝 半透半反镜
220
240
nm 260
甲醇的紫外吸收
220
240
nm 260
2020/5/26
消耗品
流动相
国产甲醇7元/瓶 国产乙腈38元/瓶
进口甲醇210元/瓶4L 进口乙腈450元/瓶4L
氘灯
SPD-10AVP
3200元/只/2000小时
SPD-10AVP用国产 1500元/只/2000小时
管接头
SUS-PEEK接头
液液萃取
液固萃取
固相萃取
上样 纯化 洗脱 洗柱
固相萃取装置--自动化富集
SPE预处理柱 子弹头式 针管式 12孔 24孔式
氮吹仪 --浓缩样品
12孔 24孔式
2020/5/26
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2020/5/26
2020/5/26
2020/5/26
2020/5/26
检测器
氘灯损坏 噪声大
检测池污染 噪声大
2 完全充满定量管
MBB(Make-Before-Break)
断流前之动作
带(i)后缀意味着有内置式触发开关
不推荐用户长时间最高压力下工作
定量管体积 0.1微升-10毫升
最高压力 35-49MPa
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2020/5/26
2020/5/26
2020/5/26
2020/5/26
2020/5/26
液相色谱仪的使用
套圈锥度 (或角度)
接头要素
2020/5/26
端口锥度 (或角 度)
液相色谱仪的使用
液相色谱仪的正确连接
•接头的普通特征
–螺纹(10-32, ¼-28, M6x1)
–管道外径(1/16”、1/32”、 1/8”) –端口几何形状(锥形、平 底) –管套直径
接头要素
2020/5/26
液相色谱仪的使用
出口 单向阀
进口 单向阀
2020/5/26
实用 快速
经济 可靠
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2020/5/26
压力从何处产生?
流动相
压差
输液泵
10MPa
7725i
0.1 9.9MPa
色谱柱
9.4
检测器
0.5MPa 0.5
0.0MPa
色谱工作站
MPa 7
2020/5/26
进样伐---7725i
进样模式
1 部分充满定量管而不浪费样品
•信号强度(S)
从朗伯-比耳定律可看出:
•样品的种类 •样品的浓度和进样的体积 •检测池的长度 •所使用的波长,检测器的时间 常数 •噪音(N)
•流动相 •所使用的波长,灯的能量 •检测器的时间常数 •非检测器的因素:电噪音、泵 脉动
1AU
10%噪音 信噪比 S/N=1AU/0.1=10
0.25AU 1%噪音
保护柱 国产550元/套(三柱芯)
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分析柱 国产1100元/只
2020/5/26
液相色谱仪的使用
整台液相色谱仪的维护
每次用过仪器后必须做!
1.在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟,此时 必须打开排放阀,不能使废液进入色谱柱。 2.关上排放阀,用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系 统,时间为15~20分钟,流量1ml/分。本步骤主要是冲 洗干净系统内其他含盐的部位。 3.用纯的强溶剂冲洗整个系统,时间为1小时,流量为 1ml/分。本步骤主要是保护色谱柱。 4.如果未使用缓冲液,上面1、2两步骤可免去,直接用 纯的强溶剂冲洗整个系统,时间为1小时,流量为1ml/分。
溶剂 A 溶剂 B
泵A
溶剂 A
泵B
混合器 (溶剂混合点) 溶剂 B
比例阀(溶剂混合点) 混合器
泵
A 高压梯度
B 低压梯度
2020/5/26
液相色谱分析
分析方法建立的实例
有机污染物的影响(一)
2020/5/26
50ml超纯水的有机物污染状态
液相色谱分析
分析方法建立的实例 有机污染物的影响(二)
“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析
2
流动相
相对检测器本底低
UV与检测条件相呼应
190nm--220nm近紫外区注意事项
样品浓度与检测器灵敏度
PH值对色谱柱影响
机械杂质、有机杂质
脱气--脱气装置质量
3
2020/5/26
有关流动相常见故障现象
泵前输液管有气泡 脱气 清洗溶剂滤头 检查输液管是否破损
过滤膜用错-保留时间变化--挥发--吸收
信噪比 S/N=0.25AU/0.01=25
2020/5/26
液相色谱紫外检测器
紫外检测器的流动相影响
•不同种类的溶剂有其不同的截止 AU
波长
•溶剂质量的好坏对其截止波长有
影响
200
•为何溶剂质量影响截止波长?
AU
1.含紫外吸收的杂质
2.溶解在其中的氧气
3.缓冲液溶剂的紫外吸收
200
乙腈的紫外吸收
2 柱填料 C18 C8 C6 NH CN ……
3 gracevydac
gracevydac/china
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2020/5/26
色谱柱维护
色谱柱安装 保护柱安装
平衡色谱柱
反向柱(C18)用甲醇 乙腈10-20倍 柱体积平衡 250×4.6柱体积约4毫升
注意柱前柱后死体积
连接件 1: SUS 一卡就死 卡过就断
2020/5/26
液相色谱分析
分析方法建立的实例 有机污染物的影响(三)
典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高 灵敏度梯度分析
2020/5/26
色谱柱
如何选择色谱柱?
1 柱效 塔板数/米 总塔板数
250毫米 70000 17000
200毫米 70000 14000
150毫米 70000 10500
4
2020/5/26
输液泵 输液泵
压力波动 压力很低
出口单向伐
入口单向伐
2020/5/26
漏液
压力很低5
FL2200液相色谱仪介绍
高压输液泵介绍
柱塞杆清洗口
排液口
红宝石球
2020/5/26
柱塞杆密封圈
宝石柱塞杆
单向阀 排液冲程
吸液口
液相色谱仪的输液泵
单向阀介绍
进口单向阀安装在泵头的下部 出口单向阀安装在泵头的上部 这样有利于气泡的排出,阀体 是不锈钢的,里面装宝石小球 ,安装在阀体进口端的是宝石 球座,在出口处装有筛网。液 体向反方向流时(从上往下) 球落入宝石球座内,阻止液体 回流。
不同柱死体积不同
2:PEEK 承受压力有限
3:SUS-PEEK 优于1 2
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2020/5/26
色谱柱损坏现象
柱效减低 峰型变矮变宽
保护柱失效
分析柱污染
柱前柱后死体积 分析柱头塌陷
色谱峰出现肩峰
何谓肩峰?
柱连接管断在柱头里
色谱柱受震动
您的色谱柱是否在病态运行
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2020/5/26
样品前处理--保护色谱柱
液相色谱仪的正确连接
•接头的普通特征
–螺纹(10-32, ¼-28, M6x1)
–管道外径(1/16”、1/32”、 1/8”) –端口几何形状(锥形、平 底) –管套直径
接头要素
2020/5/26
液相色谱仪的使用
液相色谱仪的正确连接
• 套圈固定管道,并且始终以相同方式固 定——用力按入圆锥形端口,如下图所 示……
×如果无半透半反镜和参比光电 池即为单光束分光光度计
参比光电池
钨灯 球面反射镜
比色皿
样品室
检测光电池
2020/5/26
液相色谱紫外检测器
紫外-可见光检测器
检测原理: 基于流过
池中的样品溶 液对光产生吸 收有信号差。
流动相和样品
石英玻璃
氘灯
光电池
排放
2020/Fra Baidu bibliotek/26
液相色谱紫外检测器
同紫外检测器灵敏度有关的因素
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2020/5/26
您对交流感觉如何?
请提宝贵意见! 祝您科研有成! 祝您健康,幸福!
16
2020/5/26
高效液相色谱(HPLC)
常见故障分析及其排除方法
2020/5/26
宗旨
集三十余年使用与维护仪器之经验 汇各国仪器常见故障之点滴 ------奉献给祖国的栋梁
1
2020/5/26
流动相 溶剂滤头
输液泵
在线过滤器
7725i
保护柱
色谱柱
检测器
色谱工作站
2020/5/26
HPLC流程结构
有机结合 紧密相关
2020/5/26
液相色谱仪使用中的问题
预柱与保护柱
从泵来的流 动相
预柱
进样器 保护柱
预柱对流动相而言 保护柱对色谱柱而言
2020/5/26
分析柱 到检测器
液相色谱仪使用中的问题
使用保护柱
带整体过滤片 的Techtron 保护柱
2020/5/26
色谱工作站
噪声大 不采集 不积分 爱死机 你的工作站怎样?
液相色谱仪的正确连接
…然后在套圈接触内套处压紧管壁。
接头要素
2020/5/26
液相色谱仪的使用
液相色谱仪的正确连接
•管套的深度并非通用!
•即使是最好的接头,如果不正确使用也会 产生许多问题。为什么会出现问题?
接头要素
2020/5/26
液相色谱分析
分析方法建立的实例 梯度的洗脱方式
• 高压梯度及低压梯度