第02章 遗传图绘制
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David Botstein是首先提出RFLP想法 的科学家.
PRINCETON, N.J. -- Princeton University has named David Botstein, a renowned geneticist, educator and pioneer of the Human Genome Project, as the new director of the Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics. Botstein will succeed Shirley M. Tilghman, who was the founding director of the institute and became president of the University in 2001, and James Broach, who is interim director. Botstein's appointment will begin July 1, 2003.
一篇只有想法而无实验的论文
Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet 32:314–331 这是一篇在基因组研究中具有里程碑意义的论文
AFLP的操作程序
不同 品系 基因 组 AFLP 扩放 图
第二代分子标记---SSR
1) 可变排列的简单重复顺序, 即重复次数不一, 在染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同; 2) SSR的类型: 小卫星序列(minisatellite), 重复单位较长 微卫星序列(micrisatellite), 重复单位较短, 注: 在1-6个核苷酸之间, 是常用的分子标记.
1) 这是一种筛选RFLP分子标记的方法. 先将 DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI, Sau3A)消化, 然后加上接头PCR引物. 2) 接头PCR引物设计: 根据限制酶接头添加数个 向外延伸的碱基, 然后向3’方向延伸1-3个不同 的碱基. 3) 选择不同的引物对扩放样品DNA, 经聚丙烯胺 凝胶电泳分离标记的PCR产物.
第1篇有关人类RFLP实验论文
A Highly Polymorphic Locus in Human DNA
Arlene R. Wyman and Ray White, MIT A locus in the human genome, not associated with any specific gene, has been found to be a site of restriction fragment length polymorphism. The polymorphism was found by hybridizing a 16kilobase-pair segment of single-copy human DNA, selected from the human genome library cloned in phage CH4A, to a Southern transfer of total human DNA digested with EcoRI. DNAs from a number of individuals from within Mormon pedigrees as well as random individuals have been examined. The locus is highly variable, with at least eight alleles present, homozygotes accounting for less than 25% of the individuals examined. ---PNAS | November 1, 1980 | vol. 77 | no. 11 | 6754-6758
基因 组测 序的 策略 --由上至 下 (左 ) 和由下 至上的 测序(右) 全基因组鸟枪法测序和基于克隆物理图的测序都必 须要有高密度的分子标记.
为何要用分子标记进行 基因组作图
基因组测序的基本策略是将整个基因组分 割成一些小的片段分别测序, 然后将测序的 片段进行组装, 使其回归到原来的位置. 为了确保分散的基因片段正确归位组装, 必 须寻找一批标记,它们在染色体上的位置是 已知的、唯一的、确定的, 并位于不同的测 序片段之中.
最早涉及RFLP的论文
1) Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet 32:314–331 [PubMed] 2. Gusella JF, Wexler NS, Conneally PM, Naylor SL, Anderson MA, Tanzi RE, Watkins PC, Ottina K, Wallace MR, Sakaguchi AY, Young AB, Shoulson I, Bonilla E, Martin JB (1983) Polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington’s disease. Nature 306:234–238 [PubMed] doi: 10.1038/306234a0. 3. Knowlton RG, Cohen-Haguenauer O, Van Cong N, Frezal J, Brown VA, Barker D, Braman JC, Schumm JW, Tsui LC, Buchwald M, Donis-Keller H (1985) A polymorphic DNA marker linked to cystic fibrosis is located on chromosome 7. Nature 318:380–382 [PubMed] doi: 10.1038/318380a0.
人类不同群体中存在的SNP
e t P a t i l o f
2
F i g u r e
1. The haplotype patterns for 20independent globally diverse chromosomes defined by 147 common human chr 21 SNPs spanning 106 kb of genomic sequence. 2. Each row represents an SNP. Blue box = major, yellow = minor allele. Each column represents a single chromosome. 3. The 147 SNPs are divided into 18 blocks defined by black lines.The expanded box on the right is an SNP block of 26 SNPs over 4. 19kb of genomic DNA. The 4 Most common of 7 different Haplotypes include 80% of the chromosomes, and can be distinguished with 2 SNPs.
如何检测SSR
第三代分子标记---SNP
SNP的一些特点
1) SNP由核苷酸代换产生. 2) 人类基因组平均600bp含一个SNP. 3) 人类基因组SNP总量大于500万.占人类 DNA顺序差异的10% - 50%. 4) 基因组中一些紧密连锁的SNP可组成单倍 型(Haplotype).单倍型中不同的SNP位点 之间不发生重组与交换.
第2章 遗传图绘制
结构基因组的研究策略
为何要绘制遗传图与物理图？
1)基因组太大,必需分散测序,然后将分 散的顺序按原来位置组装,需要图譜 进行指导. 2)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序, 因此要高密度基因组图. 3)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互 整合校正.
什么是遗传图?
遗传图(Genetic Map):
如何寻找RFLP标记
1) 随机克隆筛选; 2) 将其它方法获得的DNA标记, 如RAPD (random amplified polymorphism DNA) 标记转换为RFLP标记; 3) 从cDNA 中寻找RFLP. 4) 计算机筛选, 即电子Leabharlann Baidu交.
AFLP(amplified fragment lenth polymorphism, 放大的片段长度多态性)
1978年, 在犹他州盐湖城滑雪胜地艾尔 塔的一场例行的学术讨论中, 从事经典 人类遗传学研究的专家与从事分子生物 学研究的专家进行学术交流. 分子生物 学家从经典遗传学的研究中获得灵感.
Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW
David Botstein
遗传作图标记
1) 第一代分子标记,单一顺序多态性:
RFLP, AFLP, RAPD
2) 第二代分子标记, 重复顺序多态性:
Simple sequence length polymorphisrns, SSLPs Variable number of tandem repeats, VNTR Simple tandem repeats, STR Single sequence repeats, SSR
3) 第三代分子标记, 单核苷酸多态性:
Single nucleotide polymorphisms, SNP
第一代分子标记---RFLP
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段长度多态性
最早发现的DNA分子标记--RFLP
RFLP是如何想到的?
通过遗传学方法, 以遗传图距(cM) 为单位绘 制的染色体上基因或标记之间相对位置的 连锁图.
遗传图与物理图
1）遗传作图（Genetic mapping） 采用遗传学 分析方法将基因或其它 DNA 顺序标定在染色体 上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分 析。遗传图距单位为厘摩(cM), 每单位厘摩定义 为1%交换率。 2）物理作图（Physical mapping） 采用分子生 物学技术直接将 DNA 分子标记、基因或克隆标 定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法 而异，如辐射杂种（radiation hybrid）作图的计 算单位为厘镭 (cR), 限制性片段作图与克隆作图 的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp, kb)。
RFLP多态性的产生与检测(1)
子代两个亲本基因型, 两个重组基因型.
RFLP多态性的产生与检测(2)
亲子 代
RFLP
多 态 性 的 检 测
RFLP的特点
1) 处于染色体上的位置相对固定; 2) 同一亲本及其子代相同位点上的多态 性片段特征不变; 3) 同一凝胶电泳可显示等位区段不同多 态性片段, 表现为共显性. 4) 需要用Southern杂交检测显示.
基因组路标(landmarker)
染色体上的基因和DNA顺序 均可作为路标, 路标具有 物理属性,它们由特定的 DNA顺序组成. 路标位于 染色体上的位置是固定的, 唯一的,不会更改的,因而 提供了作图的依据
标记1 标记2
标记3
座位(locus)与位点(site)
Locus: 座位是经典遗传学中常用的概念, 系指染 色体上经遗传分析确定的某个位置, 它们 可以是基因、DNA顺序或分子标记. 因此 locus系指遗传单元在染色体所占据的位置. Site: 位点是指基因组物理图上某一确定的DNA 顺序. 注: 当locus是指确定的DNA顺序或基因序列时, 也可称为site.
微卫星序列（SSR）
如何寻找微卫星序列标记?
1) 1982年Hamada等首次报道microsatrllite现象 (PNAS, 79:6564, 1982) 2) 1989年Weber等从GenBank中发现人类基因组的8个 位点中, 有7个位点存在(CA)n拷贝数的变化 (Am.J.Hum.Genet., 44:388, 1989). 3) 现已证实人和老鼠基因组中平均每18-28 kb含有一个 多态性(CA)n. 4) 获取方法: a) 机算机搜寻; b) 用Sau3A, RsaI, HaeIII 或AluI限制酶酶切基因组DNA, 构建DNA文库. 合成 简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选. 5) 根据简单重复顺序两侧的序列设计引物, 用同位素标 记PCR扩增样品, 经聚丙烯胺凝胶电泳分辩.
PRINCETON, N.J. -- Princeton University has named David Botstein, a renowned geneticist, educator and pioneer of the Human Genome Project, as the new director of the Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics. Botstein will succeed Shirley M. Tilghman, who was the founding director of the institute and became president of the University in 2001, and James Broach, who is interim director. Botstein's appointment will begin July 1, 2003.
一篇只有想法而无实验的论文
Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet 32:314–331 这是一篇在基因组研究中具有里程碑意义的论文
AFLP的操作程序
不同 品系 基因 组 AFLP 扩放 图
第二代分子标记---SSR
1) 可变排列的简单重复顺序, 即重复次数不一, 在染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同; 2) SSR的类型: 小卫星序列(minisatellite), 重复单位较长 微卫星序列(micrisatellite), 重复单位较短, 注: 在1-6个核苷酸之间, 是常用的分子标记.
1) 这是一种筛选RFLP分子标记的方法. 先将 DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI, Sau3A)消化, 然后加上接头PCR引物. 2) 接头PCR引物设计: 根据限制酶接头添加数个 向外延伸的碱基, 然后向3’方向延伸1-3个不同 的碱基. 3) 选择不同的引物对扩放样品DNA, 经聚丙烯胺 凝胶电泳分离标记的PCR产物.
第1篇有关人类RFLP实验论文
A Highly Polymorphic Locus in Human DNA
Arlene R. Wyman and Ray White, MIT A locus in the human genome, not associated with any specific gene, has been found to be a site of restriction fragment length polymorphism. The polymorphism was found by hybridizing a 16kilobase-pair segment of single-copy human DNA, selected from the human genome library cloned in phage CH4A, to a Southern transfer of total human DNA digested with EcoRI. DNAs from a number of individuals from within Mormon pedigrees as well as random individuals have been examined. The locus is highly variable, with at least eight alleles present, homozygotes accounting for less than 25% of the individuals examined. ---PNAS | November 1, 1980 | vol. 77 | no. 11 | 6754-6758
基因 组测 序的 策略 --由上至 下 (左 ) 和由下 至上的 测序(右) 全基因组鸟枪法测序和基于克隆物理图的测序都必 须要有高密度的分子标记.
为何要用分子标记进行 基因组作图
基因组测序的基本策略是将整个基因组分 割成一些小的片段分别测序, 然后将测序的 片段进行组装, 使其回归到原来的位置. 为了确保分散的基因片段正确归位组装, 必 须寻找一批标记,它们在染色体上的位置是 已知的、唯一的、确定的, 并位于不同的测 序片段之中.
最早涉及RFLP的论文
1) Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet 32:314–331 [PubMed] 2. Gusella JF, Wexler NS, Conneally PM, Naylor SL, Anderson MA, Tanzi RE, Watkins PC, Ottina K, Wallace MR, Sakaguchi AY, Young AB, Shoulson I, Bonilla E, Martin JB (1983) Polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington’s disease. Nature 306:234–238 [PubMed] doi: 10.1038/306234a0. 3. Knowlton RG, Cohen-Haguenauer O, Van Cong N, Frezal J, Brown VA, Barker D, Braman JC, Schumm JW, Tsui LC, Buchwald M, Donis-Keller H (1985) A polymorphic DNA marker linked to cystic fibrosis is located on chromosome 7. Nature 318:380–382 [PubMed] doi: 10.1038/318380a0.
人类不同群体中存在的SNP
e t P a t i l o f
2
F i g u r e
1. The haplotype patterns for 20independent globally diverse chromosomes defined by 147 common human chr 21 SNPs spanning 106 kb of genomic sequence. 2. Each row represents an SNP. Blue box = major, yellow = minor allele. Each column represents a single chromosome. 3. The 147 SNPs are divided into 18 blocks defined by black lines.The expanded box on the right is an SNP block of 26 SNPs over 4. 19kb of genomic DNA. The 4 Most common of 7 different Haplotypes include 80% of the chromosomes, and can be distinguished with 2 SNPs.
如何检测SSR
第三代分子标记---SNP
SNP的一些特点
1) SNP由核苷酸代换产生. 2) 人类基因组平均600bp含一个SNP. 3) 人类基因组SNP总量大于500万.占人类 DNA顺序差异的10% - 50%. 4) 基因组中一些紧密连锁的SNP可组成单倍 型(Haplotype).单倍型中不同的SNP位点 之间不发生重组与交换.
第2章 遗传图绘制
结构基因组的研究策略
为何要绘制遗传图与物理图？
1)基因组太大,必需分散测序,然后将分 散的顺序按原来位置组装,需要图譜 进行指导. 2)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序, 因此要高密度基因组图. 3)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互 整合校正.
什么是遗传图?
遗传图(Genetic Map):
如何寻找RFLP标记
1) 随机克隆筛选; 2) 将其它方法获得的DNA标记, 如RAPD (random amplified polymorphism DNA) 标记转换为RFLP标记; 3) 从cDNA 中寻找RFLP. 4) 计算机筛选, 即电子Leabharlann Baidu交.
AFLP(amplified fragment lenth polymorphism, 放大的片段长度多态性)
1978年, 在犹他州盐湖城滑雪胜地艾尔 塔的一场例行的学术讨论中, 从事经典 人类遗传学研究的专家与从事分子生物 学研究的专家进行学术交流. 分子生物 学家从经典遗传学的研究中获得灵感.
Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW
David Botstein
遗传作图标记
1) 第一代分子标记,单一顺序多态性:
RFLP, AFLP, RAPD
2) 第二代分子标记, 重复顺序多态性:
Simple sequence length polymorphisrns, SSLPs Variable number of tandem repeats, VNTR Simple tandem repeats, STR Single sequence repeats, SSR
3) 第三代分子标记, 单核苷酸多态性:
Single nucleotide polymorphisms, SNP
第一代分子标记---RFLP
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段长度多态性
最早发现的DNA分子标记--RFLP
RFLP是如何想到的?
通过遗传学方法, 以遗传图距(cM) 为单位绘 制的染色体上基因或标记之间相对位置的 连锁图.
遗传图与物理图
1）遗传作图（Genetic mapping） 采用遗传学 分析方法将基因或其它 DNA 顺序标定在染色体 上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分 析。遗传图距单位为厘摩(cM), 每单位厘摩定义 为1%交换率。 2）物理作图（Physical mapping） 采用分子生 物学技术直接将 DNA 分子标记、基因或克隆标 定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法 而异，如辐射杂种（radiation hybrid）作图的计 算单位为厘镭 (cR), 限制性片段作图与克隆作图 的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp, kb)。
RFLP多态性的产生与检测(1)
子代两个亲本基因型, 两个重组基因型.
RFLP多态性的产生与检测(2)
亲子 代
RFLP
多 态 性 的 检 测
RFLP的特点
1) 处于染色体上的位置相对固定; 2) 同一亲本及其子代相同位点上的多态 性片段特征不变; 3) 同一凝胶电泳可显示等位区段不同多 态性片段, 表现为共显性. 4) 需要用Southern杂交检测显示.
基因组路标(landmarker)
染色体上的基因和DNA顺序 均可作为路标, 路标具有 物理属性,它们由特定的 DNA顺序组成. 路标位于 染色体上的位置是固定的, 唯一的,不会更改的,因而 提供了作图的依据
标记1 标记2
标记3
座位(locus)与位点(site)
Locus: 座位是经典遗传学中常用的概念, 系指染 色体上经遗传分析确定的某个位置, 它们 可以是基因、DNA顺序或分子标记. 因此 locus系指遗传单元在染色体所占据的位置. Site: 位点是指基因组物理图上某一确定的DNA 顺序. 注: 当locus是指确定的DNA顺序或基因序列时, 也可称为site.
微卫星序列（SSR）
如何寻找微卫星序列标记?
1) 1982年Hamada等首次报道microsatrllite现象 (PNAS, 79:6564, 1982) 2) 1989年Weber等从GenBank中发现人类基因组的8个 位点中, 有7个位点存在(CA)n拷贝数的变化 (Am.J.Hum.Genet., 44:388, 1989). 3) 现已证实人和老鼠基因组中平均每18-28 kb含有一个 多态性(CA)n. 4) 获取方法: a) 机算机搜寻; b) 用Sau3A, RsaI, HaeIII 或AluI限制酶酶切基因组DNA, 构建DNA文库. 合成 简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选. 5) 根据简单重复顺序两侧的序列设计引物, 用同位素标 记PCR扩增样品, 经聚丙烯胺凝胶电泳分辩.