高效液相色谱原理、硬件及常见问题解决方法

减少了单向阀用量 需要阻尼器 压缩因子补偿
w/o compensation with compensation
For internal use only 11
泵的类型
消除流量脉冲－并联柱塞泵
P 单向阀 B A A B 柱塞A前进
Single Piston Delivery P
Combined Delivery
(Ion-Pair)
离子交换色谱
C18、C8键合硅胶…… 阴离子交换树脂
水/有机溶剂
离子对试剂
水相/缓冲盐
离子
(Ion Exchange)
体积排阻色谱 (Size Exclusion)
阳离子交换树脂
聚苯乙烯硅胶等
对离子
水相（SEC/GFC） 有机相（GPC）
离子 大分子量化合物 聚合物
液相色谱原理

色谱柱的选择
性、电离能力选择色谱柱及流动
相。
根据化合物的性质：极性、酸碱
一般情况下，遵循相似相溶原 理。
要注意相同类型色谱柱选择性的
差异。
8
液相色谱原理

同品牌，同型号的色谱柱获得一致的选择性
Eclipse XDB C18 – Barbitals巴比妥
mAU 35 30 25 20 15 10 5 0
手动进样器
定量环
自动进样器
3．温度控制系统

柱温的精确控制对于提高色谱柱的柱效，改善 色谱峰的分离度，缩短保留时间，降低反压， 保证分析样品结果的重复性，具有不可忽视的 作用。同时升高温度可以缩短保留时间，使实 验耗时少，减少流动相的消耗。因此，一个色 谱系统需要正确控制色谱柱柱温，所以柱温箱 已成为HPLC系统中的重要配套装置。
k：容量因子；与化合物性质、流动相、键合相相关；容量因子在0-10范围内影响大。 关于分离的事实:
• 压力大小对分离度没有任何的影响! • 压力是使用小颗粒色谱柱带来的一个负面效应! • 压力不参与任何分离!
液相色谱原理

分离度与选择性因子、理论板数及容量因子
液相色谱原理

分离模式的选择
溶解性来选择分离的模式。
4
5.133 - 丝氨酸
6 8 10 12 14
6.126 - 组氨酸 6.537 - 甘氨酸 6.758 - 苏氨酸
柱温与反压
High Temperature LC-MS/MS (HTLC-MS/MS) for High Throughput Bioanalysis Daniel Tang, PhD, PDM, Michigan Laboratories, PGRD, Pfizer Pharmaceuticals
2．进样系统
负责把液态样品引入液相色谱的流动相中 进样器必须耐受液体系统产生的高压 自动进样器是进样的自动装置 进样器类型：

固定定量环形式：一般用于手动进样器，需要手动更换
定量环以适用不同进样体积的需求 流通式：一般用于自动进样器，可进样最大loop环体积 内的任意量。流通式的交叉污染也较小。
mAU 400 300
3.7 min 延迟体积 ~ 700 μL 起始等度时间约2分钟
200
100 0
0.5 mAU 400
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
min
2.6 min 延迟体积 ~120 μL 起始等度时间约0.3分钟
300
200
100
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 min
R1 O Si R1 CH3 Si CH3 R1 O Si R1 CH3 Si CH3 R1 O Si R1 PG R CH3 PG R CH3 PG R
品牌3 C18键合方式
液相色谱原理

不同选择性差异对分离度影响
品牌1 C18
特征性图谱
Rs=1.60
品牌2 C18
Rs=1.04
液相色谱原理
0.0045 0.0040 0.0035
关键点
：
流动相 固定相 相互作用
液相色谱原理

分离度公式
塔板数 选择性因子 容量因子
������������ =
������ 4
×
������ − 1 ������
×
������ ′ ������ ′ + 1
Rs：分离度；一般要求大于1.5。分离度越大越好。 N：理论塔板数；与色谱柱填料粒度、长度、均一性等相关；理论板数越高越好。 α：选择性因子；与色谱柱键合相、硅胶封端技术等相关；选择性因子越大越好。
流动相不经过预热，甘氨酸/苏氨酸、苯丙氨酸/异亮氨酸分离度达不到要求
12.128 - 胱氨酸
12.789 - 缬氨酸
15.538 - 亮氨酸
7.044 - 组氨酸
15.872 - 赖氨酸
mAU

-2 0 2
1.503 - 天门冬氨酸
2
2.403 - 谷氨酸
4
6
8
柱温与分离(经过预热器)
VWD1 A, Wavelength=338 nm (C:\AGILENT...\ 氨基酸20141031\转化糖电解质20141030 2014-10-31 14-26-47\AA对照.D)
根据化合物的性质：分子大小及 一般情况下，遵循相似相容原 理。 根据选定的模式进行色谱柱的选
择。
常见的高效液相色谱的分离模式
色谱类型 (Mode) 正相色谱 (Normal-Phase) 反相色谱 (ReversedPhase) 离子对色谱 固定相 (Stationary Phase) 硅胶，氨基、氰基、二 醇基键合硅胶…… C18、C8, C2键合硅胶 …… 流动相 (Mobile Phase) 有机溶剂 水/有机溶剂 主要适用范围 (Compound Separated) 在水中绝对不溶解的物 质或同分异构体 中性、弱酸性、弱碱性 物质
6.088 - 丝氨酸
9.153 - 丙氨酸
14.589 - 苯丙氨酸 14.716 - 异亮氨酸
8.595 - 精氨酸
10.663 - 酪氨酸
3.296 - 谷氨酸
13.171 - 蛋氨酸
4
2

不经过预热器，则甘氨酸和苏氨酸、 苯丙氨酸和异亮氨酸不能够分离。
0
-2 2 4 6 8 10 12 14 16 min
延迟体积效应
四元泵 低压混合
To ALS & Column
二元泵 高压混合
延迟体积
To ALS & Column
• 延迟体积＝梯度形成点到达柱头的体积 • 表现为梯度起点的等度保持 • 二元系统延迟体积比四元系统要小，同样条件下，二元系统的保 留时间比四元系统要短
延迟体积的影响
流速： 0.42 mL/min
1.
最佳流速范围
5.0 m
HETP (cm/plate)
0.0030 0.0025 0.0020 0.0015 0.0010 0.0005 0.0000 -0.0005
2.
3.
3.5 m 1.8 m
不同粒径色 谱柱有最佳 流速范围 小颗粒色谱 柱柱效更高 小颗粒色谱 柱的柱效随 流速升高变 化小
1
2
3
液相色谱原理

mAU 20
只有选择相同品牌、型号的色谱柱才能获得一致的选择性
品牌1 C18
10 0
0.5 mAU 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min
品牌2 C18
20
10 0 0.5 mAU 20 10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min
587项， 提取物26项，中成药1030项）。
1200 1000 800 600 400 200 0
中药材 中成药 提取物
2000年版
2005年版
2010年版
液相色谱原理
基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固 定相(stationary phase) 发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和） 的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
Eclipse XDB C18 - Xanthines黄嘌呤
5µ m
1 2
α 2，3= 1.13
5µ m
α 3，2=1.20 α 5，4=1.13 α 4，3=1.97
2 3 4 5 6 min
3
4
5
min
mAU 35 30 25 20 15 10 5 0
1
α 2，3= 1.13 3.5 µ m
1 2 3 4 5 min
高效液相色谱
原理、硬件及
常见问题解决方法
高效液相色谱在中药分析中应用
自 2000 年版开始，中国药典一部收载的 HPLC 法含量测定 308 项（中药材 170项，中药成方制剂138项），2005年版HPLC法含量测定项目进一步增 加（中药材 291 项，中成药 429 项）， 2010 年版则达到 1643 项（中药材
泵：常见二元、四元梯度可选， 二元要购买外置脱气机 四元一般集成内置高效脱气机 自动进样器：有自动可变体积或者固定定量环形式 固定定量环形式：若需要不同体积进样，需要手动 更换定量环。 柱温箱：精确控温，保证色谱重复性。 检测器：根据应用不同，多种检测器模块可选。UVVWD，UV-DAD，FLD，ELSD
泵的类型
消除流量脉冲－串联柱塞
单向阀
P
Agilent 1100 Series Pumps: Solvent Compressibility Compensation
Piston Displacement (祃)
0
System Pressure>0
System Pressure=0
脉冲阻尼器
100
One Piston Cycle TIME
柱塞B后退
相消干扰 通常也需要阻尼器 增加了单向阀的使用数量
泵的工作方式( 四元梯度)
比例阀
1、由比例阀来控制流动相比例的变化 2、可以同时使用多种溶剂，最大四种
泵的工作方式( 二元梯度)
1、由两个独立的泵来控制溶剂比例 2、只能同时使用两种溶剂 3、若要增加溶剂选择，可加入溶剂选择阀 4、质谱检测器的最佳前端 混合器
液相色谱仪的一般运行过程(示意图)
1. 高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很 大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液 泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是核心 部件。 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压 力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常 用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操 作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机 械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
品牌3 C18
液相色谱原理

选择性差异从哪里来？
R O Si R OH R O Si R OH R O Si R R1
O O CH3
R1
O
Si CH3 CH3
品牌1 C18键合方式
O
品牌2 C18键合方式
CH3
Si CH3 CH3
R1
O
Si CH3 CH3 Si CH3 CH3 Si CH3 CH3
柱温箱

柱温箱的温度控制方式：
单加热：加热块
强制风冷 或者半导体（帕尔贴）制冷
帕尔贴元件是由一排排N和P型的半导体构成，通过在半导体里面转移电荷载体(如
N型中的电子和P型中的空穴)， 从而把热从一侧转移到另外一侧。再通过改变施 加电压的极性，元件可以被用来加热或冷却溶剂，样品和色谱柱。柱温箱模块中 的风扇用于把帕尔贴元件后部产生的热量带走。
0.4mL/min
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
2 mL/min
1.0 1.2 1.4 1.6
Interstitial linear velocity (ue- cm/sec)
血塞通注射液三七总皂苷的分析
20分钟完成分析。 连续分析86针结果良好。
液相色谱仪硬件构成
液相色谱仪由各个模块组成；. 各个模块在物质分离过程中实现各自功能
3.5 µ m α 3，2=1.20
α 5，4=1.14 α 4，3=1.97
1
mAU 35 30 25 20 15 10 5 0
2
3
4
5
6
min
α 2，3= 1.14 1.8 µ m
1 2 3 4 5 min
1.8 µ m α 3，2=1.22
α 5，4=1.16 α 4，3=1.94
4 5 6 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱin
柱温与分离 (不经过预热器)
VWD1 A, Wavelength=338 nm (C:\AGILENT...\ 氨基酸20141031\转化糖电解质20141030 2014-10-31 13-04-46\AA 对照.D) mAU
8
6
1.863 - 天门冬氨酸
7.573 甘氨酸 - 7.640 苏氨酸