地衣体石果衣属共生菌的分离、培养与鉴定

地衣体石果衣属共生菌的分离、培养与鉴定

【摘要】：从陕西安塞采集石果衣属(Endocarpon sp.)地衣体标本并进行子囊孢子释放实验，成功分离出其共生菌，对此共生菌ITS序列进行分子鉴定后,将此菌转入液体培养液中培养,培养30天左右测定培养液中的总糖、还原糖和多糖含量。

【关键词】：地衣；石果衣属；共生菌；分离；培养；鉴定

地衣是由共生真菌和共生藻结合而成的稳定、自立的联合体。地衣化真菌约占真菌总数的五分之一，共525属，13500种，其中绝大多数的共生真菌是子囊菌，约占子囊菌半数以上，少数为担子菌和不完全菌类。地衣体组成形式通常可分为壳状、叶状和枝状三种生长型。其中壳状地衣通常是指形体上微小、呈水平扩展并分化程度很低的地衣体。石果衣属属于子囊地衣-瓶口衣目-瓶口衣科-瓶口衣亚科，其地衣体细鳞片状，散生或集生，常几近壳状，两面或仅上表面具假薄壁组织皮层。子囊壳埋生，子实层具共生藻，子囊1~6孢子，孢子砖壁型多胞，无色至暗褐色。为了对于地衣体菌、藻共生中的真菌进行单独研究或者用于菌、藻共生的人工重建，地衣共生真菌的分离及培养是不可缺少的。

1. 材料与方法

1.1 地衣标本

石果衣属(Endocarpon sp.) 地衣体标本采自陕西省安塞市墩滩山上。

1.2 培养基

琼脂水培养基：20克琼脂，1升无离子水；

PDA培养基：200克土豆，10克葡萄糖，20克琼脂，1升无离子水；

MY培养基：200克黄瓜，5克葡萄糖，600毫升麦芽汁，20克琼脂，400毫升无离子水；

DBD培养基：1克酵母提取物，2克大豆蛋白胨，20克葡萄糖，20克琼脂，1升无离子水；

LB培养基：10克右旋葡萄糖，1.1克硫酸锰,1克磷酸二氢钾,0.5克硫酸镁,0.2克氯化铁，0.2克硫酸锌, 100微克硫胺素，5微克生物素，1升无离子水。

1.3 石果衣属（Endocarpon sp.）共生菌的分离

分离地衣真菌的最好方法是通过子囊孢子的释放。首先，将子囊器用水浸湿后用吸水纸除去其表面的多余水层，用凡士林将子囊器固定在盛有琼脂的无菌皮氏培养皿盖顶内侧，使子囊上层面对盛有一薄层琼脂的皮氏培养皿底部。将皮氏培养皿盖好之后约几分钟或几小时之内，子囊孢子便可被释放在琼脂表面上。一个子囊器通常可以连续释放好几天。为了记录孢子释放期限，可以将子囊器固定在皮氏培养皿盖顶内侧近边缘的位置，并定期转动培养皿盖。对于子囊孢子被释放在培养皿底部琼脂层上的撞击区可以用彩笔予以标记。观察孢子时无需打开皮氏培养皿盖，而将培养皿底部朝上置于显微镜下检查即可。当孢子已经萌发后，应将含有子囊孢子的一小块琼脂切下并移接到盛有培养基的无菌试管、皮氏培养皿或三角瓶中。为了有利于单孢子分离培养，可以用减少孢子释放时间以控制孢子数量，也可以用加大孢子释放距离以便在释放后的孢子飘落中彼此拉开距离，便于单孢子分离的进行。以上操作都应在无菌条件下进行。

1.4 石果衣属（Endocarpon sp.）共生菌的ITS序列的分子鉴定

石果衣属共生菌DNA提取采用提取真菌DNA的CTAB法。

正反向引物: 18S2：-CCCTGCCCTTTGTACACA-

SL4R：-TTCGATCACTCTACTTGTGC-

PCR(50μL)扩增系统: H2O 34.7μL; Mgcl2 4μL; Buffer 5μL;dNTP 3.2μL;each primer 0.8μL;Taq enzyme(5u)0.5μL;.DNA template 1μL.

PCR(50μL)扩增条件:95℃预变性3分钟,变性94℃30秒-退火52℃30秒-延伸72℃90秒共37个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。

1.5 石果衣属（Endocarpon sp.）共生菌的液体培养

分别将0.1、0.2、0.3克石果衣属（Endocarpon sp.）共生菌转入LB液体培养基中；将0.05克石果衣属（Endocarpon sp.）共生菌分别转入含有果糖2%、8%、12%、20%（重量/体积）的LB液体培养基中；

液体培养条件：20℃，140rpm，培养30天左右；

培养液中总糖测定：采用苯酚-硫酸法；

培养液中还原糖测定：采用DNS 比色法；

培养液中多糖测定：培养液中多糖=培养液中总糖-培养液中还原糖。

2. 实验结果

石果衣属（Endocarpon sp.）共生菌的分离

2006-7-20 陕西安塞采集石果衣属地衣体标本。

2006-7-25 第一次孢子释放实验：采集地衣体标本后马上做孢子释放实验，共做100个左右含有琼脂水培养基的皮氏培养皿。

2006-8-1第二次孢子释放实验：采集地衣体标本7天后再做孢子释放实验，共做50个左右含有琼脂水培养基的皮氏培养皿，做前先将子囊孢子浸入水中，吸水6小时左右。

2006-9-17第二次孢子释放实验中有16个皮氏培养皿中的子囊孢子和共生藻被释放出来。

2006-10-3第二次孢子释放实验中又有8个皮氏培养皿中的子囊孢子和共生藻被释放出来。

当孢子已经萌发后，应将含有子囊孢子的一小块琼脂切下并分别移接到盛有PDA、MY、DBD培养基的无菌试管中，促进孢子的生长从而有利于石果衣属(Endocarpon sp.)共生菌落的形成。

3. 讨论

3.1 通常子囊孢子释放实验都是在采集标本后7天内进行，则孢子释放几率更大，而此次成功获得石果衣属孢子的释放实验是在采集标本7天后进行的，这说明孢子释放实验所要求的时间限制可以延长一些，这可能是由于从自然环境中采集的标本被放置到实验室环境中需要一段时间适应新的环境后才能更好的进行孢子释放。并且在孢子释放实验之前，将子囊器浸入水中吸水一段时间则更有利于孢子释放。虽然分离地衣真菌的最好方法是子囊孢子释放法，但其成功率较低，我认为应该不断摸索和改进地衣真菌分离方法才能更好的获得地衣体共生菌。

3.2 将已测的石果衣属(Endocarpon sp.)ITS序列在Genebank中进行比对，此共生菌与Genebank中仅有的Endocarpon pallidulum的ITS序列亲缘性最大,两者序列相似性为94%。对于本次实验所分离的石果衣属(Endocarpon sp.)种的鉴定比较复杂，还需要对地衣体标本的形态、解剖、化学等方面进一步研究才能确定。

3.3 在LB培养液中培养30天后，接种量为0.1克石果衣属(Endocarpon sp.)共生菌的LB培养液中总糖含量最多，同时果糖浓度越大的LB培养液中其总糖含量也越多,随着接种量的增加,LB培养液中还原糖的含量增加而多糖含量逐渐减少。在含有果糖8%的LB培养液中还原糖含量最多。同时随着果糖浓度的增加，LB培养液中多糖含量也在增加。

参考文献