重组质粒的鉴定和诱导表达

Identify and purify the protein
SDS-PAGE and Western Blot Analysis
四、工程菌的建立与发酵
（1）、工程菌的建立
涂盘
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 将9（即8号克隆）活化：
将8号菌种2‰接种到6ml LB+卡那 的培养基中培养，当OD600达到0.6-0.8 时，取900ul菌液和100ul的80％甘油移 入灭菌EP管中，混匀，做好标记，-20℃ 保存菌种。剩余的菌液稀释106倍后，取 150ul菌液铺于含卡那的LB琼脂板上，途 均匀，倒置于37度孵箱培养。
置37 ℃， 45 min。
10 ul 2 ul 0.5 ul 0.5 ul 6 ul 20 ul
琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒的酶切结果
取10 ul 酶切后的质粒
加2 ~ 3 ul电泳上样液，混匀。 加入点样孔
电泳： 100伏，40分钟。
注：可将 5ul 未切的质粒作为对照。
电泳结果分析
目的片段
注：分析质粒切不开的原因。
二、目的基因的亚克隆
1、什么是亚克隆
Sub cloning :
~ is to transfer foreign gene from one vector to another.
2、亚克隆时需要注意的问题 a. 方向 b. 酶切位点 c. 信号肽、起始和终止密码。
9：20~11：00
三、 外源基因的诱导表达
油移入灭菌EP管中，混匀，做好标记，-20℃保存菌种。
生长曲线
4.5 4 3.5
1 4
wenku.baidu.com
2 5
3 6
3 2.5 2 1.5
OD值
1 0.5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 16 18 21 22 23 24 26 29
h
备注： 0表示刚开始起色测的OD，之后每隔1小时测一次，共测29小时
从平板上挑取6个单克隆分别接种到6个装有50ml LB+卡那 的三角烧瓶中，37培养，当菌液有 起色时开始测样，之后每隔1小时开始测一次OD600。待OD600的值基本处于恒定时，停止检 测。 绘制OD600值-时间的生长曲线（同样当OD600达到0.6-0.8时，取900ul菌液和100ul的80％甘
实验五 重组质粒的鉴定和诱导表达
实验内容
1、重组质粒的酶切鉴定
实验回顾
质粒的提取
2、工程菌的接种培养 3、外源基因的诱导表达
一、重组质粒的酶切
在一微量离心管中加入：
8：15~9：20
1. 重组质粒DNA 2. 10 X Buffer M 3. EcoRI 4. Hind Ⅲ 5. 去离子水 总体积
R e c o m b in a n t P r o te in
Why IPTG?
CH2OH OH H
CH2OH
O
H H OH H H OH H
O
H OH
OH
H
H
OH H
O
Lactose
IPTG is an analog of lactose but can not be
hydrolyzed by galactosidase.

1-6表示6个不同克隆
生长曲线
time(h) 0 3 F3-1 0 0.736 1.704 3.008 3.064 3.476 3.808 3.808 4.024 3.680 3.588 3.304 F3-2 0 0.636 1.328 2.572 3.152 3.120 3.544 3.488 3.420 3.424 3.360 3.388 F3-3 0 0.420 1.352 2.588 3.296 3.012 3.264 3.260 3.300 3.448 3.380 3.596 F3-4 0 0.596 1.672 2.720 3.024 3.048 3.040 3.588 3.608 3.584 3.512 4.000 F1-1 0 0.552 1.448 2.512 2.744 3.240 3.144 3.248 3.312 3.224 3.000 3.044 F1-2 0 0.844 2.072 2.844 3.160 3.404 3.520 3.452 3.532 3.500 3.200 3.356 F1-3 0 0.760 1.976 2.888 3.172 3.600 3.400 3.568 3.700 3.600 3.320 3.544 F1-4 0 0.764 2.040 2.752 2.944 3.276 3.504 3.480 3.332 3.400 3.372 3.512
细菌接种后用722S可见光分光光度计，波长设定 为600nm，测定并记录其吸光度值。
2. 37℃，150 r/min摇菌培养约1 h 后，再次测定细 菌培养液的吸光度值，当其达到0.4~0.6时，加入 IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导培养 3h。
3. 结束培养收获细菌或培养液上清。对目的蛋白进行纯化 和鉴定。此次实验不包括这部分内容。
transform recombinant plasmid into expression host: BL21(DE3) Single colony
50 ml LB medium for 5 hours.
OD=0.6， induce foreign gene expression in host.
722S分光光度计使用操作步骤
– – – – – – – – – 打开仪器开关，使仪器预热30分钟。 将仪器调整到测试波长。 打开仪器盖，调整MODE键使TRANS灯亮。 将装有空白液及待测液的比色杯依次放入比色杯架内， 按0%键即可自动调整机械零点。 盖上仪器盖 ，按下100% T键即可自动调整的100%透光 度，可反复调整直到仪器显示100为止。 调MODE键使ABS灯亮，如此时仪器显示不是0.000,可调 0%ADJ键，如有变化可重复调0%一次。 依次向外拉动比色杯架使待测样品处于2、3、4位置，为 确保位置的正确到位后可前后轻轻推地动一下拉杆。 准确读出显示屏上的数据，记录下测量的光密度值。 测量完毕后关掉电源开关，仔细清洁比色杯架和仪器， 打开仪器盖放置，等待任课教师检查。
Protease-deficient host strains
BL21, the work horse of E. coli expression, is deficient in two proteases encoded by the lon (cytoplasmic) and ompT (periplasmic) genes.
It is dangerous to kill proteases, it makes E.coli grow much slowly…..
工程菌的接种培养和外源基因的诱导表达
1. 取8ml LB培养液（含抗生素）加入空试管中，再加入 80μl菌液（1/100接菌）。 注意：此操作应在超净工作台内进行。