高效表达可溶性重组蛋白表达载体_pHisSUMO

3　讨论

构建真核表达载体首先要根据其用途和基本策略进行严密的实验设计,如果将目的片段和载体质粒分别双酶切后进行连接,会因酶切效果不理想导致缺失。因此本研究采取T 载体克隆的方法将目的片段连入P M D -19T 载体中,然后从P M D -19T 重组载体上酶切下目的片段再与同样经酶切处理的PcDNA3载体进行连接,这样就保证了重组质粒PcDNA3-h LY Z 构建的成功和准确,为研究h LY Z 基因的真核表达奠定了基础[6]。

对上述阳性克隆进行DNA 测序,结果表明扩增的5’和3’调控区与已发表的序列的同源性较高。该调控序列在牛、人和鼠的相应区域进行比较同源性均为97%～100%,说明该调控序列在人、牛和小白鼠上具有较高的保守性[7]。

对于构建特异表达载体来说,5’和3’UTR 的特异启动子和调控系列尤为重要。许多研究证实其酪蛋白基因5’端和3’端UTR 及启动子是乳腺特异表达的关键调控原件。另外,乳蛋白基因UTR 是构建乳腺生物反应器表达载体的核心生物元件[8]。目前已经用于转基因动物乳腺生物反应器的调控元件主要有:β-乳球蛋白基因、aS1和β-酪蛋白调控序列、乳清酸

蛋白基因调控序列和乳清白蛋白基因调控序列[9]

。近二十年的研究证明,以β-乳球蛋白和β-酪蛋白基因调控序列构建的乳腺生物反应器表达载体在绵羊、山羊和奶牛上获得高水平表达,而乳清酸蛋白基因调控序列指导的蛋白则在兔和猪等动物上有较高水平的表达,但各有优缺点[3]。国外研究报道表明酪蛋白是在乳腺的特异表达的蛋白质,是乳腺的主要

蛋白[10]。pC -h LY Z 载体的成功建立为研究酪蛋白基因5’端和3’端的调控序列的调控机理和调控特性提供了一个平台;并用上述牛乳腺特异表达载体表达药用蛋白,建立具有产业开发价值的牛乳腺高效表达技术体系和进一步制作转基因动物奠定了基础。

参考文献:

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高效表达可溶性重组蛋白表达载体———pHisSUM O

李璐1

,尹成凯2

,李德山

23

(1.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,黑龙江哈尔滨150030;2.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030)

摘要:目的:构建含有I L -1基因的原核表达质粒,并对其原核表达情况进行检测,验证pHisS UM O 表达载体的高效可溶性表达。方法:以质粒pM D18-T -I L -1为模板,利用PCR 获得I L -1基因克隆并将其与表达载体pET 、pTY B 、pHisS UM O 连接,重组质

粒经鉴定后转化到大肠杆菌DH5

α中,并检测其蛋白表达情况。结果:仅在pHisS UM O 表达系统获得了I L -1融合蛋白的高效可溶性表达。利用Ni -NT A 纯化后的融合蛋白经S UM O 蛋白酶Ⅰ切割,获得了纯度较高的成熟蛋白且不残留任何氨基酸残基。结论:实验证明pHisS UM O 表达系统有助于增加外源蛋白可溶性和表达量。

关键词:pHisS UM O ;高效表达载体;S UM O 蛋白酶

中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2009)03-0011-04

An Expression V ector for E fficient Expression of Soluble R ecombinant

Proteins ———pH isSUMO

LI Lu 1

,YI N Cheng -kai 2

,LI De -shan

23

(1.Life Science and Biotechnique Research Center ,N ortheast Agricutural University ,Harbin 150030,China ;

2.C ollege of Life Science ,N ortheast Agricutural University ,Harbin 150030,China )

Abstract :Objective :T o construct the prokary otic expression plasmid included I L -1gene and detect the result of expression ,to verify pHisS UM O for efficient expression of s oluble recombinant proteins.Method :Plasmid pM D18-T -I L -1was taken as the tem plate firstly ,I L -1gene was cloned by PCR and connected to the expression vector pET ,pTY B and pHisS UM O ,then the recombinant plasmid was identified and trans formed

into E .coli DH5

αcom petence cell ,and the expressed protein w ould be detected.R esult :High yield of the fusion protein was only acquired in pHisS UM O expression system in s oluble form.The human I L -1with high purity was harvested without any additional amino acid residue ,after Ni -affinity chromatography purification and cleavage by S UM O protease Ⅰ.Conclusion :The data show that pHisS UM O expression system is help 2ful to enhance the s olubility and yield of interested proteins.

K ey w ords :pHisS UM O ;high efficient expressive vector ;S UM O protease

收稿日期:2008-11-07;修回日期:2009-03-20基金项目:黑龙江省科技攻关重点项目资助(G B06C315)

作者简介:李璐(1975-),女,硕士,实验师,研究方向:生物制药学;3通讯作者:李德山(1950-),男,博士生导师,教授,从事生物制药学研究,Email :deshanli @ 。

目前,重组蛋白的表达主要是利用大肠杆菌,其具有使用安全、操作简便、周期短且不存在病毒致癌基因污染等优点,是重组蛋白药物研究和生产中使用最广泛的表达系统[1,2]。重组蛋白表达关键的问题是选用合适的表达载体,现已建立

的大肠杆菌表达系统有融合表达、非融合表达、分泌表达、带纯化标签的表达载体等,而融合表达载体又有pET 系列、pTY B 、pGE M 及pGEX 等。表达载体的类型虽多,但选择合适的、满足人们需求的表达载体却很难,如pET 系列载体虽然应用较广泛,但对有些蛋白的表达却不是很理想。而其它一些融合蛋白表达系统蛋白表达量虽然很高,但多数表达的目的蛋白可溶性较差。这就要求我们去寻找更多的高效稳定、可溶性较好的表达系统以满足不同类型基因的表达。

我们在表达I L -1的过程中,发现在大肠杆菌中难以获得高效稳定的可溶性表达,其原因可能在于该蛋白在大肠杆菌