温和气单孢菌YH311硫酸软骨素裂解酶的分离纯化与固定化

［/!］ 。我们利用本实 普通变形杆菌 1"/" 制备 J=D9K3 验室 筛 选 出 的 一 株 产 J=D9K3 的 温 和 气 单 孢 菌
， 菌株： 温和气单孢菌 ［ 9%*(7($+& &(6*#+ HI -//］ 本实验室自行筛选。 培养基： 斜面培养基： !L 营养肉汤 Z "@!L 硫酸 软骨 素 Z !L 琼 脂； 种 子 培 养 基： !L 营 养 肉 汤 Z 发 酵 培 养 基： "@!L 硫 酸 软 骨 素； #@7L 葡 萄 糖 Z !@"L 蛋白胨 Z "@/L 酵母粉 Z "@/L )9J’ Z "@7L 硫 酸软骨素。 主要试剂： 硫酸软骨素 CJ 混合物， 购自宁波市 中药制药厂； D3E=9F35 G./7" 为 P=9U;9A<9 进口分装； BC:. D3E=9F35 C7" 购自中国医药集团上海化学试
。此
对于预 外， 由于低分子量硫酸软骨素 （!RO S /"RO） 防动脉粥样硬化、 风湿性关节炎和伤口愈合具有更
［/"］ 好的疗效 ， 因此酶解法制备低分子量硫酸软骨素
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材料与方法
材料
也是目前研究的热点之一。在国外， 对于 J=D9K3 的 研究比较早， 商品化的 J=D9K3 CXJ、 J=D9K3 CJ 等多 由 3*(/%)& 4),1+*#& 及 5,+4(6+0/%*#)7 "%8+*#$)7 两种菌 ［//］ ； 而 株生产， 其价格昂贵并且其生产受专利保护 仅林雪松等报道过用 国内对于 J=D9K3 的研究较少，
［/-］ 卡拉胶网格中外 ， 迄今尚无人利用固定化 J=D9K3
广泛的药理学活性：J=D9K3 可溶解椎间盘内髓核或 破裂的纤维环、 降解囊性纤维变性部位的黏液物、 阻 止玻璃体与视网膜的粘连、 促进神经轴的再生、 抗肿 瘤以及增强软骨细胞与软骨的黏附能力等
［# W 0］
的方法进行降解硫酸软骨素的研究。实验中我们将 纯化的 J=D9K3 分别通过海藻酸钠凝胶包埋法及纤 维素共价结合法进行了固定化， 经固定化后 J=D9K3 的稳定性得到了大幅度的提高。
中图分类号
硫酸软骨素裂解酶 （ A=&>FU&<6<>9K3 或 A=&>FU&<6<> 是一类能将硫酸软骨素、 K+’V963 ’,K9K3 简称 J=D9K3） 软骨素、 透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖 （! 及 寡 糖 的 裂 解 酶。随 着 对 J=D9K3 的 深 入 研 O<） 究， 人们已发现 J=D9K3 不仅可用于了解硫酸软骨素
’()*+, 的分离纯化 ."/#01 经 HIJ*/1G"#K1L I;- 柱层析及 /1G"#K1L 分离 R*,;- 凝胶过滤层析的层析图谱见图 , 和图 8，
纯化的具体结果见表 ,。由图 ,、 图 8 及表 , 可知， （AB7 ） ."/#01 经 HIJ*/1G"#K1L I;- 柱层析 8 /C7 沉淀、 和 /1G"#K1L R*,;- 凝胶过滤层析等一系列纯化步骤 后， 其比活力可达 <,5:%V、 纯化收率可达 <@? 、 最终 可纯化 ;; 倍。纯化后的 ."/#01 用 /Q/*聚丙烯酰胺 凝胶电泳法及等电聚焦电泳法检测其纯度时 （见图 图 7） 可得到单一的蛋白质条带， 经薄层扫描可知 <、 其纯度为 +;D<? 。而且通过 /Q/*聚丙烯酰胺凝胶
I’J
生
物
工
程
学
报
2( 卷
电泳可知该 !"#$%& 的分子量约为 ’()*， 通过等电聚 焦电泳可知该 !"#$%& 的等电点在 +,- . +,’ 范围内。 从分子量上看该 !"#$%& 的分子大小与文献中报道 的 !"#$"%&’(#)" ’*")+(),+ 、 !)"%-%,’+ ./0*)1’(/),+ 及 2.’3
7期
蔡苏兰等： 温和气单孢菌 WB<,, 硫酸软骨素裂解酶的分离纯化与固定化
;>;
剂公司； 蛋白质分子量标准来自中国生物制品检定 所； 两性电解质为 !"#$%#&’# 产品； 对苯二胺购自中 国医药集团上海化学试剂公司； 海藻酸钠购自中国 医药集团上海化学试剂公司； 其它试剂均为进口或 国产分析纯。 主要仪器： ()*+,-- 紫外可见分光光度计为北 京瑞利仪器分析公司产品； 电泳仪为北京六一仪器 厂产品。 !"# 方法
［,7］ 参照 2#3#45 6 等 的分离 !"#"! ."/#01 的制备： 纯化方法并略有改动。取活化的试管斜面菌株接种
固定化。首先制备胺化纤维素， 即将滤纸纤维素用 然后水洗， 打浆， 得到较均 <%EF:9 A#CB 浸泡过夜， 一的 纤 维 素。 将 ,--V 湿 纤 维 素 悬 浮 于 ,;-%9 加 入 M-%9 环 氧 氯 丙 烷， 于 ,%EF:9 A#CB 溶 液 中， 反应 ， 过滤， 水洗后， 再加入 对苯二胺 M-= <-%’3 8-V 水溶液， 于 7;= 反应 <- %’3， 抽干， 水洗后即得胺化 纤维素。然后进行固定化， 其方法为： 将 ,V 载体加 再 加 入 ,%EF:9 B.F ;D-%9 搅 拌 均 匀。 入水 <D-%9， 在 - O ;= 下 慢 慢 滴 加 ;D-%9 ;? 的 A#AC8 溶 液。 再 8-%’3 后抽干。先用冷的 -D-;%EF:9 B.F 洗 < 次， 用水洗 < 次后抽干。在磷酸缓冲液中 （ GB MD-） ， 加 入一定量的 ."/#01， 在 - O ;= 条件下反应 <" 后用水 洗 < 次， 即得固定化酶。 !"#"& ."/#01 活力的测定： （,） 溶 液 酶 活 力 的 测 定： 取 溶 液 酶 ,9 加入 ! （溶于 -D-8 %EF:9 磷酸缓 7%9 -D8? 硫酸软骨素溶液 冲液中， ， GB @D;） <@= 水浴中保温 8-%’3 后于沸水 产物于 8<;3% 处测定不饱和二糖的 浴中煮沸 8%’3， 吸光度 ! 。 固定化酶活力的测定： 取海藻酸钠包埋的固 （8） 定化酶 ,V 或纤维素共价结合的固定化酶 -D,V 加入 （溶于 -D-8 %EF:9 S$’0*B.F ;%9 -D8? 硫酸软骨素溶液 或磷酸缓冲液中， ， GB @D;） <@= 水浴中保温 8-%’3 后， 过滤取反应液于 8<;3% 处测定不饱和二糖的吸 光度 ! 。 ［,>］ 酶活力单位定义： 参考 W#%#V#X# S 等 的 （<） 方法， 规定酶活力单位为在上述条件下每分钟裂解 硫酸软骨素生成 , %EF 不饱和二糖的酶量为一个活 ! 力单位。 （7） 相对活力： 在比较范围内固定化酶或溶液酶 与相应的最高酶活力的比值 （通常以百分数表示） 。
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结果与讨论
。
等电点的测定及纯度的鉴 !"#"$ 蛋白质分子量、 ［,M］ 定： 采用 /Q/*!IRJ 法及等电聚焦电泳法 。 !"#"% ."/#01 的固定化： （,） 海藻酸钠凝胶包埋法： 配置一定浓度的海藻 酸钠凝胶溶液与酶液混合均匀， 然后用注射器针筒 滴入无菌的 -D8%EF:9 .#.F8 溶液中， 固化 8-"， 制成 最后用蒸馏水洗 直径为 < O 7%% 的球状固定化酶， 涤数次以除去未被包埋的酶。 （8） 纤维素共价结合法： 按文献 ［,@］ 中方法进行
［ 9%*(7($+& &(6*#+ HI -//］ 通过硫酸铵沉淀、 HI-// BC:.D3E=9F35 C7" 阴离子交换柱层析及凝胶过滤层 析等步骤分离纯化出了 J=D9K3 （其类型尚未确定） ， 经
收稿日期： 修回日期： !""-./!.!0， !""#."-.!1。
"通讯作者。 23’：41.!#.!-4#-$// 356 -7/-；895：41.!#.!-4#-$// 356 -7!!；:.;9<’：=9&’<>.,9>? /1-@ A&;
于种 子 培 养 基 （ 8-%9 种 子 培 养 液 :8;-%9 三 角 瓶） 中， <-= 、 >-$:%’3 条件下振荡通气培养 ,7" 后按 8? 接种量接种到发酵培养基 （ 8-%9 发酵液 :8;-%9 三 角瓶） 中， <-= 、 >-$:%’3 条件下振荡通气培养 87" 后 、 弃去菌体收集 将发酵液离心 （ ,- ---$:%’3， ,- %’3） 上清 液 ,,--%9， 然 后 将 上 清 液 用 @;? 饱 和 度 的 （AB7 ） （ ,- ---$:%’3， 。 ,- %’3） 8 /C7 沉淀过夜后离心 取沉淀用 ;-%9 -D-8%EF:9 醋酸缓冲液 （ GB ;D-） 溶解 并用 -D-8 %EF:9 醋酸缓冲液 （ GB ;D-） 透析除盐， 将 所 得 的 @- %9 样 品 上 样 于 HIJ*/1G"#K1L I;- 柱 （8DM&% N 7-&%） ， 此时 ."/#01 被吸附在层析柱上， 然 后用 -D-8 %EF:9 醋酸缓冲液 （ GB ;D-） 进行洗脱 （流 速为 ,%9:%’3， 每管收集 <%9） ， 直至无蛋白质洗出为 止， 然后换用含有 -D- O -D> %EF:9 A#.F 的 -D-8 %EF:9 醋酸缓冲液 （ GB ;D-） 进行梯度洗脱； 将活性组分合 并后， 用 2’FF’GE$1 超滤离心管 （截留分子量 ;-PQ） 离 心浓缩成 8D-%9， 将其中的 -D; %9 上样于 /1G"#K1L （ 8D-&% N ,--&%） ，用含 -D, %EF:9 A#.F 的 R*,;- 柱 进行洗脱 （流速 -D-8 %EF:9 S$’0*B.F 缓冲液（ GB @D;） 每管收集 7 %9） ， 收集活性组分。再将 为,%9:@%’3， 剩余的 ,D; %9 蛋白质浓缩液分次上样于 /1G"#K1L （ 8D-&% N ,--&%） ， 最后将所有的活性组分 R*,;- 柱 浓缩备用。 !"#"# 蛋白质含量的测定： 采用 9ET$U 法
［/ W -］ 在机体内的分布、 结构与功能 ， 而且 J=D9K3 有着
测定该 J=D9K3 的分子量为 4"RO， 等电点为 #@- S #@4。 固定化酶技术是 !" 世纪 1" 年代初期发展起来 的一项新技术， 以其操作简便、 稳定性强、 易与产物 分开等优点而被广泛应用。在国内外， 除 )&Y+,+R< D96& 等人报道过将 3*(/%)& 4),1+*#& ， )J2J#1-1 包埋于
温和气单孢菌 !"#$Baidu Nhomakorabea 硫酸软骨素裂解酶的分离纯化与固定化
蔡苏兰 阎浩林" 何汉洲
（沈阳药科大学制药工程学院， 沈阳 //""/1）
摘
要
通过硫酸铵沉淀、 对源自温和气单孢菌 BC:.D3E=9F35 C7" 柱层析及 D3E=9F35 G./7" 凝胶过滤等纯化步骤，
其最终纯度可达 07L 以 HI-// 的 J=D9K3 进行了分离纯化。结果表明， J=D9K3 经上述纯化步骤后被纯化了 77 倍， 上， 比活为 -/@41+M;N。经 DOD.PCG: 及 Q8: 测定可知该酶的分子量约为 4"RO， 等电点为 #@- S #@4。将纯化后的 固定化酶用 4"T J=D9K3 用海藻酸钠或纤维素固定化后， J=D9K3 的热稳定性及贮存稳定性均可得到大幅度的提高： 水浴处理 /!";<> 或于 #T 冰箱放置 -"F 后仍可保留 7"L 以上的相对活力； 但固定化酶的收率较低， 仅为 /4@71L 和 /4@41L 。 关键词 硫酸软骨素裂解酶， 分离纯化， 固定化酶， 海藻酸钠， 纤维素 B4/7 文献标识码 C 文章编号 /""".-"1/ （!""#） "#."74#."1
!" 卷 # 期 !""# 年 $ 月
生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
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