酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附法步骤
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酶联免疫吸附法步骤（大纲）一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述1.1ELISA的定义及原理1.2ELISA的分类及应用二、实验准备2.1试剂与材料准备2.1.1主要试剂2.1.2主要材料2.2仪器设备准备2.2.1温度与湿度控制设备2.2.2混合与振荡设备2.2.3其他仪器设备三、实验步骤3.1微孔板的包被3.1.1包被抗原/抗体3.1.2包被后处理3.2封闭3.2.1封闭液的选择3.2.2封闭处理3.3样本及标准品的加入3.3.1样本稀释3.3.2加入标准品与样本3.4抗原/抗体结合3.4.1结合时间与条件3.4.2洗涤3.5酶标二抗的加入3.5.1酶标二抗的稀释3.5.2酶标二抗的结合3.6洗涤3.6.1洗涤次数与条件3.6.2洗涤液的选择3.7显色反应3.7.1底物的选择3.7.2显色条件3.8终止反应3.8.1终止液的选择3.8.2终止反应操作四、结果与分析4.1光密度值（OD值）测定4.2标准曲线的制作4.3结果计算与判断五、实验注意事项及质量控制5.1实验操作注意事项5.2质量控制措施5.2.1试剂质量控制5.2.2设备与操作规范5.2.3数据处理与分析六、实验结果的临床应用与意义6.1ELISA在临床检测中的应用6.2ELISA结果的临床意义及局限性6.3检测结果与临床诊断的关联分析一、酶联免疫吸附法（ELISA）概述酶联免疫吸附法（ELISA），是一种常用于检测和分析生物样本中蛋白质、多肽、抗体等生物大分子的分析技术。
酶联免疫吸附试验流程
酶联免疫吸附试验流程介绍酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的实验室技术，用于检测生物样本中的特定蛋白质或其他分子。
ELISA技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
本文将详细介绍ELISA的流程及其相关要点。
一、试剂准备在进行ELISA实验之前，需要准备一系列试剂和材料，包括涂板、标准样品、检测抗体、辅助试剂等。
下面是一份常用的试剂列表：1.涂板：通常使用96孔的微孔板，常见的材料有聚苯乙烯或聚碳酸酯。
要确保涂板的表面是光洁的，没有污染或缺损。
2.标准样品：用于构建标准曲线，测定待测样本中目标分子的浓度。
标准样品的浓度应该覆盖到待测样本的浓度范围。
3.抗原或抗体：用于偶联到涂板表面或用作检测物。
抗原可以是待测分子，抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
4.阻断剂：用于阻止非特异性结合，并降低背景信号的产生。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）或干酪蛋白。
5.洗涤缓冲液：用于洗涤涂板，去除非特异性结合物。
6.辅助试剂：如辅酶、辅酶底物等，用于增强信号或催化染色反应等。
二、典型的ELISA流程下面是一个典型的ELISA流程，包括固相吸附、孔洗涤、抗原或抗体结合、检测抗体结合和信号发生等步骤。
具体流程如下：1. 固相吸附1.将待测样本加入涂板中，使目标分子与涂板表面相互作用；2.孵育一段时间，使待测分子与涂板表面结合；3.倒掉涂板中的待测样本，洗涤孔洞以去除未结合的物质。
2. 孔洗涤1.向涂板中加入洗涤缓冲液，使孔洞充分浸润；2.轻轻倾斜涂板，将洗涤缓冲液倒出，去除未结合的物质；3.重复以上洗涤步骤2-3次，以确保洗涤干净。
3. 抗原或抗体结合1.向涂板中加入检测抗体，与目标分子结合；2.孵育一段时间，使检测抗体与目标分子发生特异性结合；3.倒掉涂板中的检测抗体，洗涤孔洞以去除未结合的物质。
4. 孔洗涤请参考步骤2中的孔洗涤步骤。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在生物样本中的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前的准备工作、样本处理、试剂配制、板上实验步骤和结果分析等内容。
一、实验前的准备工作1.1 样本准备：收集样本时应注意避免污染和交叉污染，避免冻融次数过多。
样本应在规定时间内处理，避免长时间存放。
1.2 试剂准备：根据实验方案准备所需的试剂，如稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等，确保试剂的质量和稳定性。
1.3 仪器准备：准备好ELISA板阅读器和洗板机等设备，确保仪器的正常运行和校准。
二、样本处理2.1 样本稀释：根据实验需求将样本进行适当的稀释，以确保浓度在标准曲线的线性范围内。
2.2 样本处理：对于血清或血浆样本，应先离心去除悬浮物，避免干扰因子的影响。
2.3 样本保存：处理完样本后，应储存于-20℃或更低的温度下，避免多次冻融。
三、试剂配制3.1 稀释缓冲液：根据实验方案准确称取试剂，按照比例稀释，确保最终浓度符合实验要求。
3.2 洗涤缓冲液：配制洗板机所需的洗涤缓冲液，保证洗板的干净程度。
3.3 底物液：根据实验方案配制底物液，确保底物液的质量和稳定性。
四、板上实验步骤4.1 包被：将包被抗体加入到板上，孵育一定时间后洗涤，使包被抗体固定在板上。
4.2 加样本：加入样本和标准品，孵育一定时间后洗涤，去除未结合的物质。
4.3 加底物：加入底物液，孵育一定时间后停止反应，加入停止液终止反应。
五、结果分析5.1 读板：使用ELISA板阅读器测定吸光度值，绘制标准曲线并计算样本的浓度。
5.2 数据处理：根据实验方案进行数据处理，包括样本浓度的计算和结果的统计分析。
5.3 结果解释：根据实验结果进行数据解释，得出结论并撰写实验报告。
总结：ELISA操作规程是一项重要的实验技。
酶联免疫吸附实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种广泛应用于生物医学科研和临床诊断的免疫学实验技术。
它利用酶标记的抗体或抗原结合特定抗体，通过酶催化产生的色素反应来定量检测目标物质的存在。
下面是ELISA实验的具体步骤及详细说明。
1. 酶标板涂布：将特异性的抗原或抗体溶液加入酶标板孔中，密封并在4℃下过夜静置，使抗原或抗体与酶标板表面结合。
通常使用96孔多孔板，每孔涂布50-100ng的抗原或抗体。
2.检测试样：将待测样品加入酶标板中，与已固定的抗原或抗体发生特异性结合。
样品可为血清、组织提取物、细胞培养上清液等。
3.洗涤：将酶标板孔倒置于洗液缓冲液中，轻轻拍打板子，使孔内的液体充分与缓冲液混合。
然后，倒掉液体，重复该步骤3次，以充分清洗非特异性结合的物质。
4.酶标记抗体添加：加入与目标物质结合后的酶标记抗体。
酶标记抗体可以是酶标记的二抗、酶标记的蛋白A、酶标记的蛋白G等。
它与样品中的目标物质结合形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。
5.洗涤：同步酶标记抗体添加后的洗涤步骤，用洗涤缓冲液彻底冲洗非特异性结合的物质。
6.底物添加：将酶底物加入各孔中，酶底物通常是一种可被酶催化反应产生明显产物的物质。
常用的酶底物有TMB（3,3',5,5'—四甲基联苯胺）和ABTS（2,2'-联氨基二乙基苯并硫酸盐）等。
7.反应停止：在适当的时间内，加入酸性停止剂，停止酶催化反应。
酸性停止剂可以是含2MH2SO4或0.2MHCl的缓冲液。
8. 读取光密度：使用酶联免疫吸附测定仪（ELISA Reader）测量各孔的光密度。
光密度与目标物质的浓度成正比。
一般使用450nm波长进行测量。
9.结果分析：根据标准曲线上的光密度读数，可以计算出待测样品中目标物质的浓度。
通过与正常参照样品进行比较，可以确定是否存在异常浓度。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于测定生物样本中特定分子的定量方法。
它结合了免疫化学和酶学原理。
下面是对ELISA方法的详细过程及步骤的完整版说明：1.准备工作：首先，准备实验室材料，包括ELISA板、试剂、标样、洗涤液、试管、酶标板读取器等。
确保所有物品都是干净且无污染的。
2.涂覆抗原或抗体：将要测定的抗原或抗体在ELISA板的孔中涂覆。
可以将抗原或抗体溶液加入每个孔中，然后在37°C的恒温箱中孵育2到4个小时，以便其吸附在板上。
3.孔的封闭：将孔洗涤掉未吸附的物质，并用阻断液封闭孔，以防止非特异性结合。
4.样本和标准品的加入：将待测样本和不同浓度的标准品加入对应的孔中。
将ELISA板返回恒温箱，孵育一段时间，使样本和标准品中的抗原或抗体与固相相结合。
5.洗涤：将洗涤液加入孔中，用洗涤机或手动洗涤涡流器洗涤孔，以去除未结合的物质。
6.加入检测抗体：加入检测抗体，该抗体具有与待测物质结合的亲和性。
将ELISA板返回恒温箱进行孵育，使检测抗体与待测物质结合。
7.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的检测抗体。
8.加入次级抗体：加入与检测抗体结合的二抗，通常是与酶结合的抗体。
这个二抗具有抗体结合和酶活性。
9.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
10.反应底物：加入染色底物，它通常是可以与酶发生反应并产生可见信号的底物。
11.反应停止：通过加入停止液，中止底物的反应并停止信号的产生。
12.读板：使用酶标板读取器，在特定波长下测量每个孔的吸光度。
这个吸光度与待测样本中目标物质的含量成正比。
13.数据分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标物质的浓度。
总结：ELISA方法是一种常用的免疫学定量方法，它可以用于测定生物样本中特定分子的含量。
在ELISA方法中，首先将待测物质（抗原或抗体）固定在ELISA板上，然后加入待测样本和标准品，进行孵育和洗涤的步骤，以去除未结合物质。
酶联免疫吸附实验实验报告
酶联免疫吸附实验实验报告一、实验目的酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种常用的免疫学检测技术，本实验旨在通过实际操作，掌握 ELISA 的基本原理、操作步骤和结果分析方法，检测样本中特定抗原或抗体的含量。
二、实验原理ELISA 的基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微量反应板）表面，然后加入待测样品，使其与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
接着，加入酶标记的第二抗体（或抗原），形成抗原抗体酶标抗体复合物。
最后，加入底物，通过酶催化底物显色，根据显色的程度来定量或定性分析待测样品中抗原或抗体的含量。
三、实验材料与设备1、材料待测样品：＿____标准品：＿____包被抗体：＿____酶标抗体：＿____底物溶液：＿____洗涤液：＿____终止液：＿____2、设备酶标仪微量移液器恒温培养箱聚苯乙烯微量反应板四、实验步骤1、包被将包被抗体用包被缓冲液稀释至适当浓度，加入聚苯乙烯微量反应板的孔中，每孔100 μL，4℃过夜。
2、封闭次日，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤 3 次，每次 3 分钟。
然后每孔加入200 μL 封闭液，37℃孵育 1 小时。
3、加样弃去封闭液，洗涤 3 次。
将待测样品和标准品用稀释液稀释至适当浓度，分别加入孔中，每孔100 μL，37℃孵育 1 小时。
4、加酶标抗体弃去孔内液体，洗涤 3 次。
每孔加入100 μL 酶标抗体，37℃孵育 1 小时。
5、显色弃去孔内液体，洗涤 3 次。
每孔加入100 μL 底物溶液，37℃避光孵育 15 30 分钟，直至显色明显。
6、终止反应每孔加入50 μL 终止液，终止反应。
7、测定吸光度使用酶标仪在 450 nm 波长处测定各孔的吸光度值。
五、实验结果1、标准曲线的绘制以标准品的浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、待测样品浓度的计算根据待测样品的吸光度值，在标准曲线上查出其对应的浓度。
六、结果分析1、准确性分析将测定结果与已知标准值进行比较，计算相对误差，评估实验的准确性。
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告酶联免疫吸附试验实验报告酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在与浓度。
本实验旨在通过ELISA技术，检测和定量分析一种特定抗原在不同样本中的浓度变化。
实验材料和方法：1. 样本制备：收集不同来源的样本，如血清、尿液等，并进行离心分离获得上清液。
2. 酶标板涂覆：将待测抗原溶液加入酶标板孔中，保持一定的温度和时间，使抗原均匀地附着在酶标板表面。
3. 阻断：加入阻断液，封闭未被抗原占据的酶标板孔，避免非特异性结合。
4. 抗体结合：加入特异性抗体，与抗原结合形成抗原-抗体复合物。
5. 酶标记抗体结合：加入酶标记抗体，与抗原-抗体复合物结合，形成二抗夹心复合物。
6. 显色反应：加入底物，使酶标记抗体催化底物发生颜色变化。
7. 反应停止：加入停止液，终止显色反应。
8. 测定吸光度：使用酶标仪测定酶标板孔中的吸光度。
实验结果：根据测定吸光度值，我们可以得到不同样本中抗原的浓度变化。
通过比较不同样本的吸光度值，可以了解抗原在不同条件下的表达情况以及不同样本中抗原的相对浓度。
实验讨论：ELISA技术在生物医学领域具有广泛的应用，尤其在疾病诊断和药物研发方面起到了重要的作用。
通过ELISA技术，可以检测和定量分析目标抗原的存在与浓度，从而判断疾病的发生与发展，为临床诊断提供依据。
在本次实验中，我们选择了特定抗原作为目标，通过ELISA技术对其进行检测和定量分析。
实验结果显示，不同样本中抗原的浓度存在差异，这可能与样本来源、处理方法等因素有关。
通过进一步的研究和分析，可以进一步探究这些差异的原因，并为临床诊断和治疗提供更准确的依据。
此外，ELISA技术还可以用于药物研发过程中的药物筛选和药效评价。
通过检测药物对特定抗原的影响，可以评估药物的疗效和安全性，为新药的研发提供重要的参考依据。
酶联免疫吸附实验ppt课件
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫测定技术，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在。
本操作规程旨在详细描述ELISA实验的步骤和操作要求，确保实验结果的准确性和可重复性。
二、实验材料和仪器1. 实验材料：- 微孔板：96孔的ELISA板- 抗原或抗体样品- 酶标记的二抗或底物- 洗涤缓冲液：含有洗涤剂的缓冲液- 反应缓冲液：用于稀释样品和试剂的缓冲液- 底物缓冲液：用于溶解底物的缓冲液- 停止液：用于停止反应的液体- 正负对照样品- 试剂盒说明书2. 仪器：- 微孔板读数仪- 洗板机或多道洗涤器- 离心机- 定量移液器和吸头- 恒温培养箱或恒温水浴三、实验步骤1. 准备工作：- 将所有试剂和样品从冰箱中取出，并等温至室温。
- 根据试剂盒说明书，准备所需的稀释液和缓冲液。
- 预热微孔板读数仪至所需的波长。
2. 样品和试剂的加入：- 将96孔微孔板的标签面朝上，用定量移液器向每个孔中加入50μL的样品或稀释液。
- 加入正负对照样品，作为比较和验证实验结果的参考。
3. 孔洗涤：- 将洗涤缓冲液加入洗板机或多道洗涤器的洗涤槽中。
- 将微孔板放入洗涤器中，按照设备说明进行洗涤，一般为洗涤3-5次。
4. 底物加入：- 将底物缓冲液加入每个孔中，使其完全覆盖样品。
- 在避光条件下，将微孔板放置在恒温培养箱或恒温水浴中孵育一定时间，通常为15-30分钟。
5. 反应停止：- 加入适量的停止液到每个孔中，停止底物的反应。
- 轻轻摇晃微孔板，使停止液均匀混合。
6. 测量吸光度：- 将微孔板放入预热好的微孔板读数仪中。
- 选择所需的波长，并记录吸光度值。
四、数据分析1. 样品浓度计算：- 使用正负对照样品的吸光度值作为参考，根据试剂盒说明书中的标准曲线，计算样品的浓度。
2. 数据处理：- 根据实验设计和目的，进行数据的统计分析和图形展示。
- 使用适当的统计学方法，如t检验或方差分析，对实验结果进行验证和比较。
酶联免疫吸附实验的操作指南
酶联免疫吸附实验的操作指南酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA），是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析目标物（例如抗体、抗原、蛋白质等）的存在与浓度。
本文将为您详细介绍如何进行酶联免疫吸附实验的操作步骤和注意事项。
一、试剂准备1.1 缓冲液的配制根据实验需求，选择适当的缓冲溶液。
常用的缓冲液包括PBS（磷酸盐缓冲液）、TBS（三甲基氨基甲烷盐缓冲液）等。
按照说明书的要求配制缓冲溶液，并确保其pH值调整合理。
1.2 酶标板的涂布抗原或抗体根据实验要求，在96孔酶标板的每个孔中，加入特定的抗原或抗体。
将酶标板密封存放于4℃的冰箱中，充分使抗原或抗体与酶标板壁结合，一般需在4℃下孵育过夜。
1.3 酶标记抗体的标记酶标记抗体是ELISA实验的关键部分。
常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
根据标记抗体的种类和生产厂家提供的说明书，按照要求进行酶标记。
二、样品处理2.1 样品收集与保存收集样品时要注意，避免污染和损伤。
根据实验需要，可以收集血清、尿液、细胞上清等各种生物样品。
样品收集后，如果不能立即进行实验，应尽快储存于低温（4℃或-20℃）条件下，避免冻融过程对样品质量的影响。
2.2 样品稀释根据实验要求和实验样品的预期浓度，选择适当的稀释倍数。
注意，过高或过低的样品稀释倍数都会影响实验结果。
一般来说，采用2-4倍的稀释倍数，可获得较为准确的结果。
三、实验操作3.1 酶标板的孔板预处理将酶联免疫吸附试验盘从冰箱取出，并且按照孔板的编号，在正常室温下放置10-20分钟，保证孔板达到室温。
3.2 样品加入和孵育将稀释好的样品加入酶标板的每个孔中，并轻轻震荡或拍击孔板，使液体充分混合。
接下来，将孔板盖板和密封膜封上，置于摇床或恒温箱中，在适当的温度下进行孵育，一般为37℃，时间根据实验要求而定。
3.3 洗涤步骤孵育时间结束后，将酶标板倒扣在架子上，用洗涤缓冲液洗涤孔板，每孔200-300μl，每孔停留时间约30秒，每孔至少洗涤3次。
ELISA试剂及溶液配制及实验步骤
ELISA试剂及溶液配制及实验步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种广泛应用于生物化学和生物医学研究领域的分析技术。
它通过酶标记的抗体与目标物结合，并利用酶的催化作用来测量目标物的含量。
下面将介绍ELISA实验所需的试剂及溶液配制以及实验步骤。
一、试剂及溶液配制1.涂板液：将PBS溶液（1X，pH7.4）加入10%胎牛血清（FBS）中，最终浓度为1%。
用该液体涂覆96孔酶标板，在4℃下静置过夜。
涂板液的制备可以在使用前一天进行。
2.阻断缓冲液：根据实验需求选择合适的阻断缓冲液，常用的有3%BSA（牛血清蛋白）或者5%乳清。
3.洗涤缓冲液：配制PBS-T缓冲液（PBS中加入0.1%的Tween-20）。
4.标准曲线样品：按照实验需要选择合适的标准品，并按照厂家提供的方法配制标准曲线样品浓度序列。
5.样品：收集待测物样品，如血清、尿液、细胞上清等。
将样品离心去除杂质，获得清洁的上清液。
6.酶标记的一抗：选择特异性强、纯度高的一抗，如兔抗体、小鼠抗体等。
根据实验目的和待测物的性质选择合适的抗体。
7.酶标记的二抗：选择与一抗宿主不同的宿主动物制备的酶标记二抗。
根据一抗的种类和宿主动物选择相应的二抗。
8.辣根过氧化物酶标记物质（HRP）：将HRP与一抗或者二抗结合，用于检测目标物的存在。
二、ELISA实验步骤1.将涂板液倒出，用PBS-T洗板3次，每次将洗液孔内保持在饱和状态，吸尽孔内液体。
2.加入阻断缓冲液100μL/孔，孵育1小时，此过程是为了避免非特异性结合。
3.吸尽阻断缓冲液，加入稀释好的标准品和样品，每孔100μL，通常每个样品需要取3个重复孔。
同时，加入相同体积的PBS作为空白对照。
4.孵育2小时，室温孵育条件可在37℃下进行。
5.吸尽样品/标准品，用洗涤缓冲液洗板3次，每次将洗液孔内保持在饱和状态，吸尽孔内液体。
ELISA试剂用洗涤缓冲液洗涤是为了去除非特异性结合物质。
6.向每个孔中加入适量的酶标记的一抗，孵育1小时。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA试验基本步骤及材料和试剂ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测蛋白质或抗体的定性和定量方法。
它的基本原理是利用酶-抗体偶联物来检测特定目标物质的存在，通过酶催化底物的变化来实现信号的放大和检测。
下面将介绍ELISA试验的基本步骤以及相关的材料和试剂。
1.涂板：首先，将微孔板（96孔板或其他规格的板）用目标蛋白质或抗体溶液涂覆在表面上，使其吸附固定。
这一步通常称为“涂板”。
2.阻断：将蛋白质或抗体涂覆后的微孔板用阻断剂（例如牛血清蛋白、BSA）进行阻断处理，以防止非特异性结合。
3.样品处理：将待检测的样品加入到微孔板中，并与目标蛋白质或抗体结合（如果存在）。
样品通常需要经过一系列稀释步骤，以便在量化检测时得出准确的结果。
4.洗涤：使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的物质。
5.二抗处理：加入与待检测物种类对应的二抗荧光素，使其与待检测物结合。
这一步通常称为“二级标记”。
6.洗涤：再次使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的二抗。
7.底物结合：加入底物（如TMB或ABTS）并等待一定的反应时间，使酶催化底物的变化产生可观察的颜色变化。
8.反应停止：加入停止液（如硫酸、盐酸）停止底物的反应。
9.测量：利用酶催化反应产生的颜色变化通过酶标仪或光谱仪进行测量，得出待测量物的浓度或定性。
1.微孔板：一般使用96孔的微孔板，也可根据需要选择其他规格的板。
2.涂板物质：目标蛋白质或抗体等。
3.阻断剂：常用的阻断剂有牛血清蛋白（BSA）等。
4.样品：待检测的生物样品，可以是血清、细胞提取物或其他组织液。
5.二抗：与待检测物种类对应的二抗，通常是抗体。
6.底物：用于酶催化反应并产生颜色变化的化学底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）、ABTS等。
7.停止液：停止底物的反应，如硫酸、盐酸等。
8. 缓冲液：用于洗涤和稀释的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（含Tween-20的洗涤缓冲液）等。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
ELISA实验报告(两篇)
引言概述:ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用于测定抗体或抗原的定量和定性的快速、敏感和特异性的实验技术。
本文将继续讨论ELISA实验的一些重要内容，包括实验操作步骤、控制样品的使用、结果分析和解释。
通过深入了解这些实验细节，我们可以更好地理解ELISA的原理和应用。
正文内容:一. 实验操作步骤1. 准备样品和标准曲线- 收集所需的样品，可以是血清、尿液或细胞上清等。
- 确定需要测定的抗体或抗原，并准备相应的标准曲线。
2. 处理样品- 样品处理包括离心、稀释或加热等步骤，以去除可能干扰测定的物质。
3. 准备实验板- 将酶标板预先涂覆上抗体或抗原，然后用非特异性蛋白质阻断剂进行阻断。
4. 加入样品和标准曲线- 将处理后的样品和标准曲线加入预先涂覆抗体或抗原的孔中。
5. 孔洗涤和加入检测抗体- 通过洗涤孔来去除非特异性结合物质。
- 加入检测抗体，它可以是与标准曲线中的抗体相同的抗体或与待测物质结合的抗体。
6. 孔洗涤和加入底物- 通过洗涤孔来去除未结合的检测抗体。
- 加入底物，它会与酶结合并产生可测定的信号。
7. 信号检测和结果记录- 使用酶标仪测量底物的反应产物生成的光信号。
- 将光信号与标准曲线进行比较，得出待测样品中目标物质的含量。
二. 控制样品的使用1. 阳性对照样品- 阳性对照样品是已知含有目标抗体或抗原的样品，用于验证实验的准确性和可靠性。
2. 阴性对照样品- 阴性对照样品是未含目标抗体或抗原的样品，用于确定实验的特异性。
3. 反应性对照样品- 反应性对照样品是含有不同浓度目标抗体或抗原的样品，用于绘制标准曲线并进行定量测定。
4. 标准曲线的制备- 使用已知浓度的标准样品制备标准曲线，该曲线用于将光信号转换为目标物质的定量结果。
5. 控制实验条件- 控制实验条件，包括温度、时间和洗涤次数等，以确保实验的可重复性和可比性。
三. 结果分析1. 原始数据处理- 使用酶标仪测量的吸光度值为原始数据，在计算吸光度值之前，需要进行空白校正和标准曲线外推。
酶联免疫吸附法实验步骤
酶联免疫吸附法实验步骤以酶联免疫吸附法实验步骤为标题的文章如下：酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
下面将详细介绍ELISA实验的步骤。
1. 基本原理ELISA实验基于特定抗原与抗体的高度特异性结合。
通常将抗原固定在试板上，然后加入待测样品，样品中的目标分子（如抗体或抗原）与固定在试板上的抗体或抗原发生特异性结合。
最后，通过加入酶标记的二抗或底物，可以定量测定目标分子的存在和浓度。
2. 实验步骤2.1. 预处理将试板中的孔洗涤至少3次，去除未结合的物质，然后加入阻断缓冲液，封闭非特异性结合位点，防止后续步骤的非特异性结合。
2.2. 样品处理加入待测样品到试板中，使样品中的目标分子与固定在试板上的抗体或抗原发生特异性结合。
样品处理的时间和温度可以根据实验需要进行优化。
2.3. 洗涤洗涤试板以去除未结合的物质，避免后续步骤的干扰。
洗涤次数和洗涤缓冲液的类型可以根据实验需要进行调整。
2.4. 酶标记的二抗处理加入酶标记的二抗，使其与待测样品中的目标分子结合。
该二抗可以与特定抗原或抗体结合，并且具有酶标记物，例如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
2.5. 再次洗涤洗涤试板以去除未结合的酶标记的二抗，避免后续步骤的干扰。
2.6. 底物处理加入底物，例如TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）或ABTS（2,2'-氨基丙基硫酸盐）等，使其与酶标记的二抗反应产生显色或荧光。
产生的显色或荧光强度与目标分子的存在和浓度成正比。
2.7. 反应停止加入反应停止液，停止底物的反应。
反应停止液改变底物的化学性质，使其停止产生显色或荧光。
2.8. 读取结果使用酶标仪或光谱仪读取试板上的显色或荧光信号强度。
根据标准曲线或对照样品的信号强度，可以计算出待测样品中目标分子的浓度。
酶联免疫(ELISA)实验操作具体步骤及详细说明
酶联免疫（ELISA）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液10 X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 包被液：1X PBS 洗涤液：含0.05% Tween-20 的1X PBS（1X PBST）或纯水封闭液：10 mg/ml BSA(1% BSA，1X PBS 配置) 抗体稀释液：一抗、二抗均用1%BSA-PBS 2M H2SO4 终止显色：108ml 98%H2SO4，加纯水稀释到1L二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。
12.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；13.加入适当体积生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 的二抗（KT1002aReagent B），37℃湿盒孵育10min；14.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；15.加入适当体积酶标亲和素UltraTek HRP（KT1002a Reagent C）, 37℃湿盒孵育10min；16.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；17.显色：滴加适量DAB 显色液(KT1003a)至切片上，室温显色1~5min，自来水冲洗；18.复染：苏木素染色5min，蒸馏水冲洗5min；19.分化：0.5%盐酸乙醇混合液中分化，自来水冲洗3-4 次，PBS 中浸泡10-20 秒返蓝，自来水冲洗2 次。
免疫酶联免疫吸附实验报告
免疫酶联免疫吸附实验报告免疫酶联免疫吸附实验报告免疫酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测和定量测定生物样本中特定抗原或抗体的存在。
本实验旨在通过ELISA法检测某种病毒感染后产生的抗体水平，以评估免疫系统的应答能力。
实验材料和方法：1. 样本制备：收集病毒感染后的血清样本，离心去除细胞和颗粒物，得到清澈的血清。
2. 酶标板涂布：将目标抗原溶液加入酶标板孔中，孵育一段时间，使抗原吸附于酶标板表面。
3. 洗涤：将洗涤缓冲液加入酶标板孔中，轻轻摇动，倒出液体，重复此步骤多次，以去除未结合的抗原。
4. 反应：加入待测血清样本和辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人免疫球蛋白G（IgG）抗体，孵育一段时间，使抗体与抗原结合。
5. 洗涤：重复第三步骤，去除未结合的抗体。
6. 显色：加入底物溶液，使底物与HRP发生反应，产生可见的颜色。
7. 终止反应：加入终止液，停止底物与HRP的反应。
8. 测定：使用酶标仪测定吸光度，根据标准曲线计算待测样本中抗体的浓度。
实验结果：根据实验操作步骤，我们成功地进行了ELISA实验，获得了一系列吸光度值。
通过绘制标准曲线，我们可以将吸光度值转化为抗体浓度。
进一步分析数据，我们发现不同样本的抗体浓度存在差异。
这表明，病毒感染后，机体会产生相应的抗体作为免疫应答的一部分。
讨论与分析：ELISA法是一种高灵敏度、高特异性的实验方法，广泛应用于医学、生物学和疾病诊断领域。
通过本实验，我们验证了ELISA法的可行性，并获得了关于抗体水平的有用信息。
在实验过程中，我们注意到样本制备的重要性。
样本的质量和处理方式会直接影响实验结果的准确性。
因此，在实验前，我们需要仔细选择和处理样本，确保样本中的抗原或抗体得到充分释放和稳定。
此外，实验中的洗涤步骤也非常重要。
洗涤的目的是去除未结合的抗原或抗体，以减少非特异性信号。
实验二_酶联免疫吸附实验(ELISA)
实验二酶联免疫吸附实验（ELISA）一、实验目的熟练掌握ELISA 技术二、实验原理酶联免疫吸附实验（ELISA）是目前应用最多的免疫酶技术, 它是使抗原或抗体吸附于固相载体, 使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行, 从而简化了分离步骤, 提高了灵敏度, 即可检测抗原, 也可检测抗体。
实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。
为了检测抗原可用夹心法。
将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上, 然后加被测溶液, 倘样品中有相应抗原, 则与抗体在载体表面形成复合物。
洗涤后加入酶标记的特异性抗体, 后者通过抗原也结合到载体的表面。
洗去过剩的标记抗体, 加入酶的底物, 在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比, 可用肉眼观察或分光光度计测定。
为了检测抗体可用间接法。
使抗原吸附于载体上, 然后加入被测血清, 如有抗体, 则与抗原在载体上形成复合物。
洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。
洗涤后加底物显色, 有色产物的量与抗体的量成正比。
本实验使用的乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒是采用双抗原夹心法检测抗-HBs, 即采用纯化HBsAg 包被反应板, 加入待测标本, 同时加入HBsAg-HRP, 当标本中存在抗-HBs 时,该抗-HBs 与包被HBsAg 结合并与酶结合物形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP 复合物, 加入TMB 底物产生显色反应, 反之则无显色反应。
三、实验仪器和试剂1.仪器设备: 微量移液器、恒温箱2.试剂和材料（1）蒸馏水（2）人血清样品（3）乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒四、实验步骤和注意事项1.实验准备: 从冷藏环境中取出试剂盒, 在室温下平衡30 分钟, 同时将浓缩洗涤液作1: 20 稀释。
2.加待测标本: 加入待测标本每孔0.05 毫升, 并设抗-HBs 阳性对照2 孔, 抗-HBs 阴性对照2 孔, 空白对照1 孔。
（试剂使用前应摇匀, 并弃去1-2 滴后垂直滴加, 注意均匀用力）3.加酶结合物: 每孔0.05 毫升, 空白对照孔不加, 充分混匀, 置37℃孵育30 分钟。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA操作规程，包括试剂准备、样品处理、板涂覆、孵育、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，配制适当的缓冲液，例如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三倍磷酸盐缓冲液-Tween 20缓冲液）等。
2. 酶标板涂层抗体的制备：将特定抗体稀释至适当浓度，加入涂层液中，进行孵育。
三、样品处理1. 样品收集：收集待测样品，如血清、尿液等。
2. 样品预处理：根据实验要求，对样品进行适当的处理，如稀释、离心等。
四、板涂覆1. 涂层液加入：将酶标板中的孔加入涂层液，注意避免气泡的产生。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使抗体与孔壁结合。
五、孵育1. 样品加入：将经过处理的样品加入酶标板的孔中。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使待测物与抗体结合。
六、洗涤1. 洗涤液准备：配制适当的洗涤液，如TBST。
2. 洗涤：将洗涤液加入酶标板孔中，轻轻摇晃或使用洗涤器进行洗涤，去除未结合的物质。
七、检测1. 二抗加入：将特定的二抗加入酶标板的孔中，与待测物结合。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使二抗与待测物结合。
3. 洗涤：使用洗涤液洗涤酶标板，去除未结合的二抗。
4. 底物加入：将底物加入酶标板孔中，使酶与底物反应产生可测量的信号。
5. 反应停止：加入适当的反应停止液，停止底物反应。
八、数据分析1. 读板：使用酶标仪读取各孔的吸光度值。
2. 数据处理：根据实验设计和标准曲线，计算出待测物的浓度或相对含量。
3. 统计分析：对实验数据进行统计学分析，如均值、标准差、相关性等。
九、结果解读根据数据分析的结果，结合实验目的和背景知识，解读实验结果，得出相应的结论。
十、结论根据ELISA操作规程的步骤和结果解读，得出实验的结论，并讨论实验的可靠性和局限性。
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酶联免疫吸附（ELISA）实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
（2）研究抗酶抗体的合成。
（3）显现微量的免疫沉淀反应。
（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。
本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。
因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。
我们用在霍乱肠毒素的测定。
HbSAg及HbS的测定。
具体步骤
一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。
二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。
四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。
六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。
八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。
九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。
注意事项
1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。
许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。
但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。
2.包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。
如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。
此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。
3.对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。
4.用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。
可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定OD值，选择OD值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。
一般总是要选择那个OD值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。
阴性参考血清OD值要求<0.1-0.2。
也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的OD值有明显差别。
5.抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。
温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。
但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。
在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1
mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。
但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用PH 7.2-7.4 PBS稀释才是满意的。
包被特异蛋白质的浓度为1-10 ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml较为合适，但均应通过滴定。
一、ELISA的影响因素
1. 固相载体
可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。
许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。
但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。
由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。
国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目前已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结果。
但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。
实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。
特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。
因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板或塑料管抽样，用0.2 ug/ml纯化的正常人IgG进行包
被，经洗涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应，再经孵育洗涤，加底物显色终止反应后，逐孔在酶标比色计中测定其消光值、光密度（OD值）。
一般认为全板中每两孔间OD值的误差不超过10%为合格。
如果中间孔与四周孔OD值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的OD值相差大，均不合格。
此外，还要检查阳性和阴性参考血清OD值是否有明显差别。
一般要求有10倍左右的差异为合格，微量反应板或塑料管在使用前并不一定通过特殊处理。
用蒸馏水冲洗即可应用。
2. 抗原
在ELISA中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果都有影响。
包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。
如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。
此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。
经试验证明，适用于其他血清学试验的抗原并非均适合用于ELISA法。
因此，对某一疾病的诊断，必须通过实践，才能选出适用的优质抗原。
对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超声波抗原、冻融抗原、细菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、细菌的外毒素以及用表面活性剂(如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA时，必须要有1-2种试剂、要求纯化，但用表面活性剂提
取的抗原在包被前必须透析除去表面活性剂，否则就不易吸附到固相载体上去。
此外，对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。
在用特异性抗体包被固相载体时也要提纯。
用抗原或抗体蛋白包被固相载体时选择的浓度要适当。
如浓度太高，则低效价抗体可能测不出来，或包被过量形成多层抗原吸附，故在操作过程中可能脱落从而降低敏感性和可重复性。
用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。
那么用多大浓度抗原进行包被最为合适呢？可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定OD值，选择OD 值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。
一般总是要选择那个OD值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。
阴性参考血清OD值要求<0.1-0.2。
也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的OD值有明显差别。
抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。
温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。
但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。
在用聚
苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。
但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用PH 7.2-7.4 PBS稀释才是满意的。
包被特异蛋白质的浓度为1-10 ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml较为合适，但均应通过滴定。