脂肪干细胞运用

ADSC s 的分离与纯化关于ADSCS勺获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS夜冲洗干净后，用0. 1%的胶原酶在37C下振荡消化48

90mi n,再用含10%胎牛血清的等体积DME培养基终止。1200r /min离心5~10min,弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4X 105/cm接种于50ml培养瓶内。37C 条件5%的CO饱和湿度培养箱内培养，2d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70%〜8O%融合时用0. 25%胰酶消化，并传代。经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大,随后细胞体积渐增大,克隆形成。经传代后,细胞的形态及排列才趋于一致。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物, 因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显示：传至第 3 代时,可达95%以上的细胞纯度。

ADSCS勺生物学特性

ADSC s 的分离与纯化1. ADSCS的鉴定

在ADSCS鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44 OCT一4，E—eadherin ，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSC具有遗传稳定性。

ADSC分泌多种生长因子

在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）胎盘生长因子（PGF）、转化生长因子一B（TGF- B）、成纤维细胞生长因子（FGF 一2）等，低表达的因子有Ang 一2C。

2. ADSCS的多向分化能力

与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。

向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、

吲哚美辛及1 一甲基一3〜异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCS向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR—r2、leptin（瘦素）、Glut4（葡萄糖转运蛋白等。镜下观察可见胞内有空泡形成。这些特点是脂

肪细胞形成的标志。

向血管内皮细胞分化：将ADSC置于含甲基纤维素和血管内皮生长因子的半固体培养基中加以培养，镜下可见有分支状的管腔结构形成，免疫组化证实有内皮细胞特异性的表面标记一CD31和vW因子。

Planat等描述了将培养3d的ADSC注入后肢缺血损伤的实验小鼠后肢肌肉中，15d以后给以血管造影及多普勒检查发现损伤后肢血供出现显着改善的实验结果。

向成骨细胞分化:h —ADSC在加入维生素C B一磷酸甘油(BGP)和维生素D3的培养基中培养几代后，细胞表面形成的突起，其形态与体内的成骨细胞相似，用茜素红染色可见细胞内出现了钙小结”。国外有将ADSCS乍为种子细胞植入网状支架中，成功地修复狗的颅骨的报导。国内马舟涌等将获得的脂肪干细胞和进行成骨诱导后的脂肪干细胞分别种植在复合骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶支架上，并移植到骨缺损模型中。实验证明，经诱导后的脂肪干细胞在复合骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶支架中可以促进骨骼愈合。这也间接证明了ADSC啲确向成骨细胞分化。

向软骨细胞分化：在体外，将维生素C转化生长因子(TFG)、胰岛素添加到特定培养基里，可以定向诱导AD-SCs向软骨细胞分化。结果在培养基里形成了细胞小结，经免疫组化分析得知，这些细胞小结表达H型胶原纤维、硫酸软骨素、硫酸角质素等。杨亚军等用CDMPI 体外诱导sD 大鼠脂肪干细胞，结果诱导后的脂肪干细胞形态由长梭型向

软骨细胞的多角形方向转变。免疫组化显示CDMP诱导大鼠ADSC后可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖（GAG）和H型胶原，并进一步向软骨细胞方向分化增殖。

向心肌细胞分化：从脂肪组织中分离的脂肪基质血管组分（stromalvascularfraction , SVF）即脂肪组织去除成熟脂肪细胞后，所获得的具有于细胞特性的基质细胞，直接种植在半固体的甲基纤维素培养基中，6d后，出现了各种不同的细胞形态，有成群的前脂肪细胞／脂肪细胞，成纤维样细胞等等，11—14d 后，一些圆形的细胞开始了独立的收缩活动，在几天内，肌管样结构出现，并大量生长增殖，20—30d 后，局部出现了一簇有结合力的细胞群体，和有分支的纤维细胞共同结合在一起。在这期间，24d时，整个局部出现了单一节律的搏动。在分子水平上，这些搏动的细胞能表达几种心脏特有的mRNA如转录因子，GATA一4和Nkx2. 5,心室和心房肌凝蛋白轻链MLC一2v和MLC一2a,以及ANP（心钠素）。这些数据表明了这些搏动细胞的心肌细胞特性。

向神经细胞方向分化：国外一些研究人员用B一巯基乙醇（B —mercaptoethanol , B—ME诱导h—ADSCS向神经细胞分化，30min 后即出现类神经元样的细胞, 3h 后出现了神经元细胞表型,表达神经细胞早期阶段的标志性因子nest in、NSE NeuN等，这证明了ADSCs 能在体外分化为神经前体细胞，目前技术水平尚不能使之向成熟的神经元细胞或星型胶质细胞分化。

ADSCS勺临床应用前景展望

1. 在组织工程中的应用

应用组织工程有两种方案，一种是将种子细胞在体外接种于支架上培养，然后再进行移植；一种是将种子细胞与可降解材料复合物直接移植到体内诱导目标组织形成。目前脂肪干细胞应用于临床仍处于动物实验阶段。有报道利用脂肪干细胞和支架成功地修复了骨缺损模型中犬勺骨缺损。

脂肪干细胞在修补受损伤勺组织时与体外生物I 型胶原支架材料勺相容脂肪干细胞具有增殖能力和多向分化潜能。对多种组织勺损伤具有良好勺修复作用。而且取材方便, 是组织工程研究中勺重要种子细胞之一。不同材料对细胞勺生长、分化和黏附均有不同勺影响, 因而种子细胞能否在支架材料上良好生长, 并表达自身特异性功能是目前组织工程研究勺一个热点。

I 型胶原支架材料与脂肪干细胞具有良好勺体外生物相容性，而且具有对细胞、组织等无毒性；不影响生物体勺生长、增殖等功能。有实验表明用体外生物I 型胶原支架材料与脂肪干细胞进行体外混合培养，证明了脂肪干细胞能在I 型胶原支架材料上良好勺附着、生长、增殖并在三维支架材料内保持均匀分布。故I 型胶原支架可作为构建脂肪组织工程的细胞载体。I 型胶原作为体外细胞培养支架时. 有促进细胞粘附和诱导生长分化的作用，是良好的培养粘附剂。其降解产物可被细胞利用合成新的基质。不产生毒性代谢产物，不影响内环境pH值，因此不会影响细胞的