脂肪干细胞

二、脂肪源间充质干细胞的优点
首先，从人类医学角度说，获取脂肪间充质干 细胞比骨髓源性干细胞容易的多。皮下脂肪切除术 是一种普通的外科手术，其安全性高、对患者带来 的痛苦小。即AMSCs具有易获得性、安全、可迅 速扩增及多向分化能力等特点，其将成为具有广阔 治疗应用前景的一类成体干细胞。
脂肪间充质 干细胞优点
油红O染 色
B
成脂诱导
诱导后充脂细胞明显增多
（×100）
脂滴融合, 胞核位于细胞一侧
（×200）
诱导后的脂肪细胞经油红O染色后,脂滴呈红色
脂肪细胞标志基因表达
成脂诱导
PPARγ595 bp β-actin 399 bp
B
d
PPAR-γ mRNA表达丰度
0.8
c 0.6
0.4
b
0.2
a
0.0
0
2
6
其次，脂肪组织比骨髓中所含干细胞比率大。 通 过成纤维细胞集落形成单位比较脂肪组织显示，成人 骨髓来源细胞中成纤维细胞集落形成单位出现频率为 1/50000～1/1000000，而当脂肪组织用胶原酶消化， 除去上层漂浮的成熟脂肪细胞，下层细胞中成纤维细 胞集落形成单位的频率为1/100，说明脂肪组织中干细 胞数目至少是骨髓的500多倍 。
脂肪间充质干细胞
Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells
汇报提纲
一. 研究背景 二. 脂肪干细胞优点及表面标记 三. 多向分化潜能 四. 猪脂肪干细胞分离培养、诱导分化及其建系 五. 应用前景及待解决的问题
一、研究背景
动物体内，脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和 赋形组织，还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细 胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致 肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此，脂肪细胞分化 的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之 一。
背景知识
干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。目前的成体干细 胞主要是骨髓来源的间充质干细胞。胚胎干细胞因道德伦理 问题限制了其应用。骨髓来源的间充质干细胞是一类具有多 向分化潜能的细胞，但骨髓穿刺给病人带来的痛苦大，且只 能得到少量细胞(大约1个间充质干细胞/105基质支持细胞)， 因而存在取材困难、病人不易接受的缺点。因此，国内外研 究人员积极寻找可替代的干细胞来源。
因此，AMSCs细胞系的建立可为研究脂肪细胞分化 全过程，探讨脂肪细胞分化早期细胞与分子事件提供新的 研究模型。
本实验室在成功分离猪原代AMSC细胞后，细胞单克 隆扩增方法获得单一来源的AMSC细胞，传20代后细胞形 态一致，经鉴定仍然具有AMSC表面标志。
细胞单克隆扩增培养
所有细胞均来源于同一祖细胞，细胞形态一致
表面标记
报道文献
Gronthos， 2001
Zuk，2002
De Ugarte， 2003
Aust，2004
AMSCs表面标记
阳性
阴性
CD44、CD49d、CD49e、 CD54、CD55、CD59、 CD105、CD106和HLA-ABC
CD14、CD45、CD50、 CD56、HLA-DR和骨髓 基质细胞表面分子
AMSCs的培养特性
A
B
细胞培养7-8 天后，细胞生长即可达80 %-90 %融合，贴壁细 胞紧密排列成漩涡状、网状、辐射状，有一定的方向性，集落大小 不一，含数个至数百个细胞不等；集落中细胞形态为典型梭形细胞 (图A)，这就是我们所要分离获得的猪AMSCs。原代培养14 d 左右 即可形成致密单层(图B)。
脂肪间充质 干细胞优点
最后，从经济和社会效益看，从脂肪组织中获 取干细胞可将原本认为是废弃物的脂肪，如临床上 脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后不可实用的 内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源，具有极大的 经济与社会效益。
表面标记
关于脂肪间充质干细胞标志，目前尚无统一标 准。一般认为，脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干 细胞均表达CD44、CD105、STRO-1、CD166及 CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体，在全 能或多能干细胞中表达，包括胚胎干细胞。
STRO-1
CD13、CD29、CD44、 CD105、CD71、STRO-1
CD14、CD16、CD31、 CD34、CD45、CD106、
CD56
CD13、CD29、CD44、 CD105、CD90、STRO-1
CD49d、CD54、CD34、 CD106
CD10、CD13、CD29、CD44、CD11b、CD45和HLA-
成肌诱导第14天，可检测到肌红蛋白(myoglobin)的表 达(图A)，第21天表达明显增加（图B)。
肌细胞标志基因mRNA的表达
成肌诱导
β-actin 399 bp MyoD 243 bp Myf5 154bp
RT-PCR 检测成肌标志基因的表达 1为对照，2为Myf5(成肌调节因子)，3为MyoD(生肌决定因子)
表面标记
除了上述几种标记外，脂肪间充质干细胞也表 达其他多种分子标记，包括CD29（β1-整合素，在血 管发生治疗中起重要作用）、CD44（透明质酸盐） 和CD49e（α5 -整合素，在细胞粘附纤连蛋白中起重 要作用）等。
表面标记
不同研究组对脂肪间充质干细胞表面标记的鉴 定结果并不完全一致，如Gronthos等发现AMSCs不 表达STRO-1，但Zuk等发现表达STRO-1。这些不一 致的结果可能与细胞所处状态及纯度有关。
上图是用5-氮杂胞苷诱导1周后的结果，由图可以看出, 诱导一周 后即可检测到成肌细胞分化早期表达基因Myf5和MyoD的表达。
成脂诱导后的形态学观察
A
C
成脂诱导
诱导48 h (×100)
B
脂滴融合 (×200)
D
诱导21 d (×100)
对照21 d (×100)
猪脂肪间充质干细胞经成脂诱导48h后，细胞胞浆内出现个别脂滴 (图A)，随着诱导时间的延长,充脂细胞数量增加(图B) ，且小脂滴逐渐 融合成大脂滴(图C)。对照组细胞无充脂细胞出现（图C）。
背景知识
2001年 Zuk等首次从病人脂肪组织悬液中分离获 得了有多向分化能力的细胞，并将其命名为抽脂处理细 胞（PLA）。PLA在特异性诱导剂下可分化为成骨细胞、 软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。之后，多个研究小组 相继证实，脂肪组织中确实存在着与骨髓间充质干细胞 相似的成体干细胞。脂肪间充质干细胞的发现进一步拓 宽了脂肪组织领域的研究。
结果：在成骨诱导分化的早期（第7天），可检测到成骨特 异性基因Ⅰ型骨胶原和骨钙素的表达，随着诱导时间的增加，2 个基因的表达量呈上升趋势。
成骨诱导
上述结果说明：在合适诱导剂下，猪脂肪 间充质干细胞形态和排列均发生变化，成纤维 样的长梭形变为成骨样的方块形，细胞堆积呈 卵圆形或方形，茜素红染色和 RT-PCR均表明 可以诱导分化成骨细胞。
肝实质细胞
在2006年4月第16卷4期的自然科学进展上，裴雪涛 等人发表的文章《人脂肪来源的干细胞体外培养特性及 分化为肝细胞样细胞的研究》。
四、猪AMSCs的培养及诱导分化
脂肪源性干细胞的分离因物种不同消化方法不同。本实验 室采用型胶原酶消化法分离获得猪脂肪源干细胞，表达脂肪 干细胞表面标记，在合适诱导剂下，这些细胞分化成了成骨 细胞、成肌细胞和脂肪细胞，在此作一简单介绍。
猪AMSC细胞系建立的初步研究
研究表明，脂肪细胞由中胚层间充质干细胞发育而来， 近30多年来对脂肪细胞的研究主要使用的是鼠源性前体脂肪 细胞系和原代前体脂肪细胞。但是这两者都是已经定向的单 能细胞，只能分化为成熟的脂肪细胞，因此这两个体外培养 体系的研究只能局限于前体脂肪分化为成熟脂肪细胞这一阶 段的细胞和分子事件。
成肌诱导后的形态学观察
A
B
C
D
成肌诱导
成肌诱导第7天出现细胞球形变化(A)，诱导第14天开始出现接 触、融合。部分出现伪足，形态变长(B)，诱导第21天周围梭形细 胞明显减少，形成巨大的球形细胞(C,D)。上图为茜素红染色。
免疫荧光染色
成肌诱导
成肌诱导后肌红蛋白(myoglobin)免疫荧光染色
成骨诱导后的形态学观察
A
B
成骨诱导
在地塞米松、抗坏血酸和β－磷酸甘油钠的诱导作用下，猪脂肪 间充质干细胞逐渐由成纤维样的长梭形（对照组，图A）变为成骨 样的方块形，细胞堆积呈卵圆形或方形（图B） 。
成骨诱导
B B
C
茜素红染色检测诱导细胞的矿物质沉积状况，结果：猪脂肪间 充质干细胞在成骨诱导第7天开始出现小的点状钙化斑（A），诱 导第14天形成广泛的钙化结节（B）。诱导21天钙化结节更加明显 连接成片（C）。D为对照组。
24代细胞表面marker鉴定
CD105＋
CD44＋
目前我们正在对保存的细胞进行染色体核 型分析，支元体检测等工作。
五、AMSC应用前景及待解决的问题
现有的研究表明，脂肪组织是一个易获取和储量丰富的成体 干细胞库。AMSCs取材容易，创伤小，具有可控制的多向分化能 力，对于组织工程来说，几乎是个“完美”的细胞；且细胞培养、 扩增较容易，易获得大量可供自体或异体移植使用的干细胞；在 急、慢性骨、软骨组织损伤，肌组织缺损、矫形手术、中枢神经 系统损伤及其它领域有潜在应用价值。
ห้องสมุดไป่ตู้
14
诱导天数
AMSCs成脂诱导后第2天可以检测到脂肪细胞标志基因PPARγ的 表达,且随着诱导时间的增加,其表达水平也增加。
成脂诱导
由上述结果可以看出，猪脂肪间充质干细胞在地塞 米松、胰岛素、吲哚美辛等的诱导作用下，细胞形态发 生变化，由长梭形变为充满脂滴的脂肪细胞。油红O染色 和 RT-PCR均表明可以诱导分化脂肪细胞。
细胞类型
诱导物
细胞特性
脂肪细胞 地塞米松,异丁基甲基黄 细胞中充满脂滴，油红o染色
嘌，胰岛素等
阳性
成骨细胞 2-磷酸抗坏血酸, β-甘油 钙化性基质产物 ，茜素红染
磷酸 ，地塞米松等
色阳性
骨骼肌细胞 地塞米松，氢化可的松， 多核形态，骨骼肌肌性素重
或5-氮杂胞苷
链/MyoD表达
心肌细胞 5-氮杂胞苷
细胞圆形，α-肌动蛋白和肌 钙蛋白-I表达
神经元细胞 β-巯基乙醇或者异丁基甲 细胞缩小、周围有多个神经
基黄嘌, 消炎痛等
突起
内皮细胞 血管内皮细胞生长因子， 细胞之间形成网格样结构 ， 碱性成纤维细胞生长因子 表达内皮细胞特异性抗原
肝(实质)细 肝细胞生长因子， 抑瘤 表达白蛋白和 α-胎蛋白
胞
素M
但若将该细胞应用于临床，仍需在动物模型上进行 大量安全性和有效性的实验。尽管AMSCs实际应用过程 中仍存在一些需要解决的问题，如体外培养是一种优化 过的环境，而体外培养后的AMSCs能否适应体内环境而 继续生长分化；在体内AMSCs分化控制过程中能否排除 致瘤性风险及是否发生免疫紊乱等。
心肌 成骨 软骨
Rangappa, 2003；Planat-Benard, 2004；Yamada, 2006(棕 色脂肪组织)；张端珍, 2005；王燕, 2005
Zuk, 2001, 2002；Halvorsen, 2000；Hattori, 2004； 陈希哲, 2004
Huang, 2004；Winter, 2003；严笠, 2005
RT-PCR检测标志基因mRNA的表达
成骨诱导
β－actin OCN 165bp
COL-1 539bp β－actin
RT-PCR检测成骨标志基因COL- 1 （Ⅰ型骨胶原）及OCN（骨钙素）表达 M: marker; 1-4分别为第0天，7天，14天，21天OCN的表达; 5-8为COL- 1的 表达。
脂肪 Zuk, 2001, 2002；Sen, 2001；Von Heimburg D, 2001
神经 Safford, 2004；Ashjian, 2003；Rchman, 2004；杨立业, 2003, 2004
多向分化潜能
脂肪间充质干细胞向不同细胞分化是在特异性 诱导因子作用下进行的。
下面介绍常用的一些多向诱导分化因子及诱导 后的细胞特性。
CD90、和HLA-ABC
DR
三、多向分化潜能
多向分化潜能
近几年的研究结果表明，在合适诱导剂下，脂 肪间充质干细胞和骨髓干细胞一样，可向脂肪、软 骨、成骨、神经元细胞、成肌细胞、血管内皮细胞 等方向分化。
多向分化潜能
Strem BM, 2005
分化 方向
骨骼肌
相关文献
Mizuno, 2002；Bacou, 2004；陈希平, 2004
AMSCs的表面标记
CD44+ (×50)
CD105+ (×100)
CD14– (×50)
CD34– (×100)
CD106– (×100)
HLA-DR– (×50)
利用免疫组织化学方法检测猪AMSCs特异性表面标记，结果： CD44和CD105呈阳性。CD14，CD34,CD106,HLA-DR均为阴性。