脂肪干细胞
脂肪干细胞制备
脂肪干细胞制备
1、准备手术器械，进行严格消毒处理。
2、在手术过程中，医生将通过局部麻醉药对抽脂部位进行麻醉。
3、使用注射器将肿胀液（含有局麻药和生理盐水的混合物）注射
到脂肪层中。
4、使用吸引器将脂肪组织吸取出来，并将其收集在一个容器中。
5、对收集到的脂肪组织进行过滤和清洗，以去除其中的血液、肿
胀液和杂质。
6、将处理后的脂肪组织中的单个细胞分离出来，并将其培养在特
定的培养基中。
7、在培养基中添加一些生长因子和营养物质，以促进脂肪干细胞
的增殖和分化。
8、培养过程中需要进行多次换液和清洗，以确保细胞的健康生长。
9、在培养过程中，脂肪干细胞将逐渐增殖并分化成不同类型的细
胞，如成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞等。
10、最后，将培养好的脂肪干细胞进行冷冻保存，以备后续使用。
脂肪干细胞运用
ADSCs的分离与纯化关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。
目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。
首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用0．1％的胶原酶在37℃下振荡消化4O～90 min，再用含10％胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。
1 200 r／min离心5～10 min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4×105／cm 接种于50ml培养瓶内。
37℃条件5％的CO 饱和湿度培养箱内培养，2 d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70％～8O％融合时用0．25％胰酶消化，并传代。
经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。
细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。
经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致。
由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。
然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。
流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95％以上的细胞纯度。
ADSCs的生物学特性1.ADSCs的鉴定在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。
用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，E—eadherin，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。
ADSCs分泌多种生长因子在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGF—B)、成纤维细胞生长因子(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2 C。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后A C Ss的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除AS Cs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DM EM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsi n,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（C D29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
脂肪干细胞
・专科小词典・
脂肪干细胞
脂肪干细胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ）是一种从脂肪组织中分离提取出的能够贴壁生长、具有可塑性、黏附性和多向分化潜能的中胚层来源的成体干细胞。
２００１年，Ｚｕｋ等通过脂肪抽吸术，在吸出的人体脂肪悬液中第一次分离得到了多向分化的干细胞。
传代后培养的ＡＤＳＣｓ，多角细胞逐渐减少，传代至第三代时基本消失，大多为梭形细胞，胞浆核仁十分丰富，与骨髓间充质细胞基本没有区别，多次传代后细胞生长速度也无减慢趋势，显示出ＡＤＳＣｓ具有易获得、易扩增、不易衰老的明显优势。
ＡＤＳＣｓ表面的免疫标识会随传代的次数而发生改变，其中ＣＤ１６６、ＣＤ１０６、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ６３、ＣＤ４４、Ｃ２９在最初表达量较低，随传代次数的增加而显著增加；与干细胞相关的表面标志ＣＤ３４一直持续较高的表达水平。
ＡＤＳＣｓ一般不表达ＣＤ６２、ＣＤ５６等。
ＡＤＳＣｓ可以分化为源于中胚层的多种细胞类型，包括骨骼肌、心肌、软骨、脂肪、成骨等，向心肌细胞分化能力是最低的。
此外还可以分化为源于外胚层的神经细胞和源于内胚层的胰腺细胞。
ＡＤＳＣｓ还可能有助于血管和造血细胞的生成。
由于脂肪组织在人体大量存在，取材容易，少量组织即可获取大量干细胞，能够在体外稳定增殖且衰亡率低，适宜大规模培养，对被采集者身体健康影响小，加上真空负压抽脂术已是成熟的整形技术。
因此ＡＤＳＣｓ显示出了其他干细胞所不能及的应用前景。
（广州医科大学附属第一医院骨科严广斌整理）・８５３・中华关节外科杂志（电子版）２０１６年６月第１０卷第３期 ＣｈｉｎＪＪｏｉｎｔＳｕｒｇ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｄｉｔｉｏｎ），Ｊｕｎｅ２０１６，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３。
脂肪干细胞实验报告
一、实验背景随着生物科技的发展，干细胞研究已成为医学领域的前沿课题。
脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）作为一种易于获取、增殖能力强、多能性的干细胞，在组织工程、再生医学等领域具有广阔的应用前景。
本研究旨在探讨脂肪干细胞的分离、培养、鉴定及其在组织工程中的应用。
二、实验目的1. 探讨脂肪干细胞的分离、培养及鉴定方法。
2. 研究脂肪干细胞在组织工程中的应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脂肪组织、DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、青霉素、链霉素、抗生素、鼠抗人CD105抗体、鼠抗人CD34抗体、鼠抗人CD29抗体、鼠抗人CD44抗体、鼠抗人CD45抗体等。
2. 实验仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 脂肪干细胞的分离与培养（1）将脂肪组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用DMEM/F12培养基清洗3次，去除多余脂肪。
（2）加入0.25%胰蛋白酶消化脂肪组织，37℃水浴消化30分钟，1000r/min离心5分钟，弃上清。
（3）加入DMEM/F12培养基重悬细胞，吹打均匀，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 脂肪干细胞的鉴定（1）采用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
（2）采用流式细胞术检测脂肪干细胞表面标志物CD105、CD34、CD29、CD44、CD45的表达。
3. 脂肪干细胞在组织工程中的应用（1）将脂肪干细胞接种于生物降解支架材料上，构建组织工程化脂肪组织。
（2）将组织工程化脂肪组织植入小鼠皮下，观察其成活情况。
五、实验结果1. 脂肪干细胞的分离与培养成功分离出脂肪干细胞，细胞呈梭形，生长旺盛。
2. 脂肪干细胞的鉴定免疫荧光染色和流式细胞术结果显示，脂肪干细胞表达CD105、CD34、CD29、CD44，不表达CD45。
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪干细胞的临床应用
09级生科一班 青美芳 孙倩
脂肪干细胞定向分化及临床应用
• 概述 • 脂肪干细胞的定义
• 脂肪干细胞的分离、培养与鉴定
• 脂肪干细胞成脂及成骨分化的影响因素 • 同时影响成脂和成骨分化的因素 • 脂肪干细胞的临床应用
概述
随着城市化进程加速，肥胖在我国尤其是大城市
发病率增长迅速。肥胖是由于长期的能量摄入超 过能量消耗引起的脂肪组织过剩的疾病。在成人 阶段脂肪细胞数量保持恒定是一种细胞死亡与补 充更新的动态平衡过程。然而相关研究提示，成
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2.分化诱导因子
• • 表皮生长因子 成纤维因子
•
3.其他（拉伸应变 、 透明质酸 、
氧浓度、钙离子）
同时影响成脂和成骨分化的因素
干细胞巢（ stem cell niche）
干细胞巢即干细胞周围的微环境构成，一般包括干细胞的 相邻细胞、粘附分子及基质等。干细巢为干细胞提供了一 个隐蔽的场所，直到有分化号的刺激它才脱离静止的状态。 因此干细胞巢在维持干细胞的静止和抑制分化方面发挥着 重要作用。
将分离的脂肪组织在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline PBS）中充分清洗，以去除毛发 和油滴等；然后将脂肪组织用眼科剪剪碎，加入 胶原酶在37℃水浴摇床消化30min, 用含有 10%FBS的 DMEM/F-12培养基终止消化，细胞 筛过滤后，800rpm/min 预离心，上清液2400 rpm/min离心得到的沉淀即为SVF，其中含有 ADSCs，用含有10%FBS的 DMEM/F-12培养基 重悬细胞沉淀，将单细胞悬液种植到培养瓶或培 养板中，37℃，5% CO2孵箱孵育。
脂肪干细胞培养方法 组织块培养法
脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。
脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。
一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。
2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。
脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。
二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。
2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。
三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。
2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。
通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。
在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。
脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。
希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。
《人脂肪干细胞(ADSCs)的分离培养及多向分化潜能研究》范文
《人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究》篇一一、引言人脂肪干细胞（ADSCs）作为一种重要的细胞资源，近年来在医学和生物学领域中引起了广泛关注。
这种细胞类型不仅在临床医学上被广泛应用于治疗各种疾病，同时在科学研究领域，它的多向分化潜能及生物机制也是备受瞩目的研究方向。
本文就人脂肪干细胞的分离培养方法和多向分化潜能的研究进行了系统性的探讨。
二、人脂肪干细胞的分离培养1. 分离方法人脂肪干细胞的分离主要依赖于酶解法。
首先，从供体脂肪组织中获取足够的细胞，通过使用含有特定酶的溶液（如胶原酶）来分解脂肪组织，使ADSCs得以释放。
随后，通过离心和筛选过程，获取纯度较高的ADSCs。
2. 培养方法ADSCs的体外培养通常使用含有生长因子和营养物质的特殊培养基。
这些培养基提供了细胞生长所需的营养和环境条件。
在培养过程中，应定期更换培养基，以确保细胞持续得到所需的营养供给。
同时，也需要关注细胞的生长状况和活力。
三、多向分化潜能研究1. 分化为成骨细胞ADSCs具有分化为成骨细胞的能力，这一过程可以通过添加适当的诱导剂和调节生长因子来实现。
在分化过程中，可以通过观察细胞的形态变化和特定基因的表达情况来评估其分化的程度和效果。
2. 分化为成脂细胞ADSCs还可以分化为成脂细胞，这一过程可以通过调整培养基中的营养成分和生长因子来实现。
成脂细胞的分化可以通过观察细胞的脂滴形成和特定基因的表达情况来评估。
3. 分化为神经细胞除了成骨细胞和成脂细胞外，ADSCs还具有向神经细胞分化的潜能。
这一过程可以通过特定的诱导剂和培养条件来实现。
对分化后的神经细胞进行功能测试和基因表达分析，可以评估其分化的效果和潜能。
四、结论通过对人脂肪干细胞的分离培养和多向分化潜能的研究，我们可以更好地了解这种细胞的特性和功能。
ADSCs的分离培养方法已经相对成熟，使得我们可以获取大量的细胞进行后续研究。
同时，ADSCs的多向分化潜能也为临床治疗提供了新的可能性和思路。
6、脂肪干细胞知识
脂肪干细胞知识什么是脂肪干细胞（ADSC）？脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells, ADSCs）是一种存在于脂肪组织中的间充质干细胞，在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10%-20%，具有一般干细胞的特点，即自我更新和多向分化潜能；这种细胞群易于分离，与骨髓间充质干细胞（BMSCs）一样在特定条件下可分化为骨、软骨、心肌等；可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术获得，在体外培养可稳定扩增，不易衰老，免疫荧光及流式细胞仪检测显示这种多能干细胞大多数来源于中胚层。
ADSCs作为间充质干细胞，其可以向内、中、外胚层细胞分化，在不同的诱导条件下ADSCs的分化方向不同，同时来源于中胚层的成骨细胞和脂肪细胞之间可能存在着某种联系。
通过研究ADSCs成脂成骨分化的影响因素，可能会找到治疗肥胖的新靶点以及骨组织工程学的新思路。
已有研究证实，从脂肪组织中分离的一小部分组织特异性干细胞有能力分化成各种细胞谱系，这种细胞基质来源的祖细胞已被定义为''脂肪来源干细胞''（ASCs），预计会成为一种极有价值的用途广泛的细胞疗法。
脂肪组织不仅包含脂肪干细胞，还含有多能干细胞，可以分化为脂肪，骨，软骨，以及其他类型的组织。
之前我们发现，使用传统抽脂机，脂肪组织中的干细胞在抽脂和移植过程中大量流失，ASCs 的不足可能导致了脂肪组织生存率下降，移植后期组织萎缩。
因此，在自体脂肪干细胞辅助移植法中，我们提取富含ASCs的新鲜SVF补充入移植脂肪组织。
为最大限度地发挥ASCs的生理活性并避免意外，我们认为，重要的是确保所补充的ASCs与脂肪组织或结缔组织紧密黏合。
有了这种新型疗法，ASCs可发挥四个主要作用，部分已被临床前研究证实。
首先，ASCs可以分化成脂肪细胞和促进脂肪组织再生。
其次，ASCs能够分化成血管内皮细胞，也可能进入血管壁细胞，促进血管生成和提高移植物存活率。
第三，ASCs众所周知可释放对抗缺氧和其他不利条件的血管内皮生长因子，而这些因子可影响周围宿主组织。
综述——脂肪干细胞与脂肪移植
王岩斐自从美国加州大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles, UCLA）的研究人员在《细胞分子生物学》（Molecular Biology of the Cell）杂志介绍了这种新型成体干细胞群以后，脂肪干细胞（the adipose-derived stem cells, ADSCs）逐渐成为普遍应用于干细胞领域中的最受欢迎的干细胞群[1]。
由于其自身存在的多向分化潜能，和获取ADSCs的简单实用性，ADSCs将成为多能胚胎干细胞（pluripotent ES cells）的替代物，无论是在实验室仍是在临床应用中。
长期以来，对于各类原发的和继发的软组织缺损的医治一直是困扰整形外科医生的难题之一。
引发软组织缺损的原因有严重烧伤、感染、体表肿瘤切除术后、各类外伤和先本性疾病等[2]。
自体脂肪作为一种软组织填充物，由于其诸多的并发症曾一度被人们放弃，但随着组织工程技术及细胞生物学的发展，自体脂肪移植又逐渐被人们认可。
现将脂肪干细胞在脂肪移植中的作用及其临床应用现状综述如下。
1 脂肪移植的发展概况20世纪初，自体脂肪颗粒作为一种软组织填充材料开始应用于临床。
但是，由于其吸收率高、存活率低，且并发症较多，限制了其在临床中的普遍应用[3]。
21世纪初，通过改良脂肪获取技术，加速了脂肪血管化，提高了脂肪颗粒移植的成活率。
可是，坏死、吸收仍然是颗粒脂肪移植的主要并发症。
直到Zuk等[1]第一次从自体脂肪组织中分离取得具有多向分化潜能的细胞——ADSCs，脂肪移植的研究愈来愈深切，原因就是ADSCs来源丰硕，取材方便，且组织中干细胞含量丰硕（ADSCs在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10%-20%[4]），不会引发伦理学争议等。
最近几年来，随着组织工程技术的迅速发展，为克服常规注射颗粒脂肪移植的问题，如吸收、囊肿、硬结等，Yoshimura等[5]又发明了细胞辅助的脂肪移植术（cell-assisted lipotransfer, CAL），该技术是将ADSCs与脂肪细胞混合，联合注射移植。
脂肪干细胞
脂肪干细胞第一节脂肪干细胞的生物特性2001年，Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分理处一种多向分化干细胞，因其与骨髓间充质干细胞（BMSC）形态相似而称为脂肪间充质干细胞（ASC）。
此后几个研究小组也先后采用相似的分离方法分别从脂肪组织中分离得到ASCE。
近年来许多研究表明，脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能，是一种理想的种子细胞。
因脂肪干细胞具有分化为脂肪的潜能，且其具有易获得性、可迅速扩增、不衰老等特点，目前脂肪干细胞已经成为脂肪组织工程中组织细胞的研究热点。
1. 脂肪干细胞的分离、培养脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低，要利用脂肪干细胞就必须进行体外分离培养扩增。
常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心，倾去上层脂肪及上清，获得基质血管层，将其收集到培养瓶中培养，除去未贴壁的红细胞和残渣，剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物。
原代培养的细胞中贴壁的细胞较少，细胞生长至融合后传代，传代后的细胞称为脂肪干细胞。
平均每300mL脂肪组织可获得2×10~6×10个这样的细胞。
体外培养条件下，ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求，DMEM、aMEN、RPMI1640是ASC 的常用培养基。
一般只添加体积分数为10%的胎牛血清，并且血清无生产批号限制。
在传代培养中，平均倍增时间为60h。
并表现低水平衰老，1代时细胞没有出现衰老现象，10代时少于5%细胞出现衰老，15代时衰老细胞比例仍低于15%，这表明脂肪ASC体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。
2.脂肪干细胞的鉴定Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。
但部分学者采用流式细胞仪和间接免疫荧光等方法，分别以因子Ⅷ、平滑肌蛋白、ASC的特异单克隆抗体鉴定ASC中是否存在内皮细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞，结果发现前两种单克隆抗体抗阳性染色的细胞比例较少，绝大多数ASC单克隆抗体阳性染色的细胞，提示ASC主要由成纤维细胞以及来自间叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。
人脂肪干细胞的生物学特性及分化研究
人脂肪干细胞的生物学特性及分化研究人脂肪干细胞（Human adipose-derived stem cells, hASCs）是来源于脂肪组织的一种成体干细胞。
相对于其他干细胞源，如骨髓和胎盘组织，脂肪组织是一种易获取、丰富的干细胞源。
脂肪干细胞具有多种生物学特性，这些特性使其成为医学研究和应用中的热点。
脂肪干细胞具有自我更新的能力。
在体外培养条件下，脂肪干细胞能够连续增殖并形成克隆球。
脂肪干细胞在体内能够不断自我更新并恢复受损组织。
脂肪干细胞具有多向分化潜能。
在适当的诱导条件下，脂肪干细胞可以向多种细胞类型分化，包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞等。
脂肪干细胞能够通过不同的分化路径进行再生医学和组织工程研究。
脂肪干细胞的多向分化潜能与其内含的多种细胞表面标志物密切相关。
脂肪干细胞表面标志物包括CD34、CD73、CD90、CD105等。
这些标志物的表达情况可以用于对脂肪干细胞的鉴定和纯化。
脂肪干细胞还具有多种富血管生成策略的能力。
研究表明，脂肪干细胞能够分泌多种生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶（MMPs），从而促进新的血管生成。
这一特性使得脂肪干细胞在组织修复和再生方面具有巨大潜力。
脂肪干细胞在临床应用中也表现出良好的安全性和可行性。
临床研究表明，脂肪干细胞植入可以用于丰胸、隆鼻、面部填充等美容整形手术，以及骨科、神经科、心血管科等疾病的治疗。
脂肪干细胞是一种具有广泛研究和应用潜力的成体干细胞。
它的自我更新能力、多向分化潜能、富血管生成策略和临床可行性，都使得脂肪干细胞成为再生医学和组织工程领域的热点研究对象。
随着研究的深入，相信脂肪干细胞将在更多领域中发挥重要的作用。
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脂肪 Zuk, 2001, 2002；Sen, 2001；Von Heimburg D, 2001
神经 Safford, 2004；Ashjian, 2003；Rchman, 2004；杨立业, 2003, 2004
多向分化潜能
脂肪间充质干细胞向不同细胞分化是在特异性 诱导因子作用下进行的。
下面介绍常用的一些多向诱导分化因子及诱导 后的细胞特性。
脂肪间充质干细胞
Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells
汇报提纲
一. 研究背景 二. 脂肪干细胞优点及表面标记 三. 多向分化潜能 四. 猪脂肪干细胞分离培养、诱导分化及其建系 五. 应用前景及待解决的问题
一、研究背景
动物体内，脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和 赋形组织，还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细 胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致 肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此，脂肪细胞分化 的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之 一。
脂肪间充质 干细胞优点
最后，从经济和社会效益看，从脂肪组织中获 取干细胞可将原本认为是废弃物的脂肪，如临床上 脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后不可实用的 内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源，具有极大的 经济与社会效益。
表面标记
关于脂肪间充质干细胞标志，目前尚无统一标 准。一般认为，脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干 细胞均表达CD44、CD105、STRO-1、CD166及 CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体，在全 能或多能干细胞中表达，包括胚胎干细胞。
成肌诱导后的形态学观察
A
B
C
D
成肌诱导
成肌诱导第7天出现细胞球形变化(A)，诱导第14天开始出现接 触、融合。部分出现伪足，形态变长(B)，诱导第21天周围梭形细 胞明显减少，形成巨大的球形细胞(C,D)。上图为茜素红染色。
免疫荧光染色
成肌诱导
成肌诱导后肌红蛋白(myoglobin)免疫荧光染色
成肌诱导第14天，可检测到肌红蛋白(myoglobin)的表 达(图A)，第21天表达明显增加（图B)。
肌细胞标志基因mRNA的表达
成肌诱导
β-actin 399 bp MyoD 243 bp Myf5 154bp
RT-PCR 检测成肌标志基因的表达 1为对照，2为Myf5(成肌调节因子)，3为MyoD(生肌决定因子)
但若将该细胞应用于临床，仍需在动物模型上进行 大量安全性和有效性的实验。尽管AMSCs实际应用过程 中仍存在一些需要解决的问题，如体外培养是一种优化 过的环境，而体外培养后的AMSCs能否适应体内环境而 继续生长分化；在体内AMSCs分化控制过程中能否排除 致瘤性风险及是否发生免疫紊乱等。
RT-PCR检测标志基因mRNA的表达
成骨诱导
β－actin OCN 165bp
COL-1 539bp β－actin
RT-PCR检测成骨标志基因COL- 1 （Ⅰ型骨胶原）及OCN（骨钙素）表达 M: marker; 1-4分别为第0天，7天，14天，21天OCN的表达; 5-8为COL- 1的 表达。
CD90、和HLA-ABC
DR
三、多向分化潜能
多向分化潜能
近几年的研究结果表明，在合适诱导剂下，脂 肪间充质干细胞和骨髓干细胞一样，可向脂肪、软 骨、成骨、神经元细胞、成肌细胞、血管内皮细胞 等方向分化。
多向分化潜能
Strem BM, 2005
分化 方向
骨骼肌
相关文献
Mizuno, 2002；Bacou, 2004；陈希平, 2004
AMSCs的表面标记
CD44+ (×50)
CD105+ (×100)
CD14– (×50)
CD34– (×100)
CD106– (×100)
HLA-DR– (×50)
利用免疫组织化学方法检测猪AMSCs特异性表面标记，结果： CD44和CD105呈阳性。CD14，CD34,CD106,HLA-DR均为阴性。
24代细胞表面marker鉴定
CD105＋
CD44＋
目前我们正在对保存的细胞进行染色体核 型分析，支元体检测等工作。
五、AMSC应用前景及待解决的问题
现有的研究表明，脂肪组织是一个易获取和储量丰富的成体 干细胞库。AMSCs取材容易，创伤小，具有可控制的多向分化能 力，对于组织工程来说，几乎是个“完美”的细胞；且细胞培养、 扩增较容易，易获得大量可供自体或异体移植使用的干细胞；在 急、慢性骨、软骨组织损伤，肌组织缺损、矫形手术、中枢神经 系统损伤及其它领域有潜在应用价值。
细胞类型
诱导物
细胞特性
脂肪细胞 地塞米松,异丁基甲基黄 细胞中充满脂滴，油红o染色
嘌，胰岛素等
阳性
成骨细胞 2-磷酸抗坏血酸, β-甘油 钙化性基质产物 ，茜素红染
磷酸 ，地塞米松等
色阳性
骨骼肌细胞 地塞米松，氢化可的松， 多核形态，骨骼肌肌性素重
或5-氮杂胞苷
链/MyoD表达
心肌细胞 5-氮杂胞苷
AMSCs的培养特性
A
B
细胞培养7-8 天后，细胞生长即可达80 %-90 %融合，贴壁细 胞紧密排列成漩涡状、网状、辐射状，有一定的方向性，集落大小 不一，含数个至数百个细胞不等；集落中细胞形态为典型梭形细胞 (图A)，这就是我们所要分离获得的猪AMSCs。原代培养14 d 左右 即可形成致密单层(图B)。
背景知识
2001年 Zuk等首次从病人脂肪组织悬液中分离获 得了有多向分化能力的细胞，并将其命名为抽脂处理细 胞（PLA）。PLA在特异性诱导剂下可分化为成骨细胞、 软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。之后，多个研究小组 相继证实，脂肪组织中确实存在着与骨髓间充质干细胞 相似的成体干细胞。脂肪间充质干细胞的发现进一步拓 宽了脂肪组织领域的研究。
14
诱导天数
AMSCs成脂诱导后第2天可以检测到脂肪细胞标志基因PPARγ的 表达,且随着诱导时间的增加,其表达水平也增加。
成脂诱导
由上述结果可以看出，猪脂肪间充质干细胞在地塞 米松、胰岛素、吲哚美辛等的诱导作用下，细胞形态发 生变化，由长梭形变为充满脂滴的脂肪细胞。油红O染色 和 RT-PCR均表明可以诱导分化脂肪细胞。
心肌 成骨 软骨
Rangappa, 2003；Planat-Benard, 2004；Yamada, 2006(棕 色脂肪组织)；张端珍, 2005；王燕, 2005
Zuk, 2001, 2002；Halvorsen, 2000；Hattori, 2004； 陈希哲, 2004
Huang, 2004；Winter, 2003；严笠, 2005
STRO-1
CD13、CD29、CD44、 CD105、CD71、STRO-1
CD14、CD16、CD31、 CD34、CD45、CD106、
CD56
CD13、CD29、CD44、 CD105、CD90、STRO-1
CD49d、CD54、CD34、 CD106
CD10、CD13、CD29、CD44、CD11b、CD45和HLA-
表面标记
除了上述几种标记外，脂肪间充质干细胞也表 达其他多种分子标记，包括CD29（β1-整合素，在血 管发生治疗中起重要作用）、CD44（透明质酸盐） 和CD49e（α5 -整合素，在细胞粘附纤连蛋白中起重 要作用）等。
表面标记
不同研究组对脂肪间充质干细胞表面标记的鉴 定结果并不完全一致，如Gronthos等发现AMSCs不 表达STRO-1，但Zuk等发现表达STRO-1。这些不一 致的结果可能与细胞所处状态及纯度有关。
细胞圆形，α-肌动蛋白和肌 钙蛋白-I表达
神经元细胞 β-巯基乙醇或者异丁基甲 细胞缩小、周围有多个神经
基黄嘌, 消炎痛等
突起
内皮细胞 血管内皮细胞生长因子， 细胞之间形成网格样结构 ， 碱性成纤维细胞生长因子 表达内皮细胞特异性抗原
肝(实质)细 肝细胞生长因子， 抑瘤 表达白蛋白和 α-胎蛋白
胞
素M
因此，AMSCs细胞系的建立可为研究脂肪细胞分化 全过程，探讨脂肪细胞分化早期细胞与分子事件提供新的 研究模型。
本实验室在成功分离猪原代AMSC细胞后，细胞单克 隆扩增方法获得单一来源的AMSC细胞，传20代后细胞形 态一致，经鉴定仍然具有AMSC表面标志。
细胞单克隆扩增培养
所有细胞均来源于同一祖细胞，细胞形态一致
结果：在成骨诱导分化的早期（第7天），可检测到成骨特 异性基因Ⅰ型骨胶原和骨钙素的表达，随着诱导时间的增加，2 个基因的表达量呈上升趋势。
成骨诱导
上述结果说明：在合适诱导剂下，猪脂肪 间充质干细胞形态和排列均发生变化，成纤维 样的长梭形变为成骨样的方块形，细胞堆积呈 卵圆形或方形，茜素红染色和 RT-PCR均表明 可以诱导分化成骨细胞。
其次，脂肪组织比骨髓中所含干细胞比率大。 通 过成纤维细胞集落形成单位比较脂肪组织显示，成人 骨髓来源细胞中成纤维细胞集落形成单位出现频率为 1/50000～1/1000000，而当脂肪组织用胶原酶消化， 除去上层漂浮的成熟脂肪细胞，下层细胞中成纤维细 胞集落形成单位的频率为1/100，说明脂肪组织中干细 胞数目至少是骨髓的500多倍 。
表面标记
报道文献
Gronthos， 2001
Zuk，2002
De Ugarte， 2003
Aust，2004
AMSCs表面标记
阳性
阴性
CD44、CD49d、CD49e、 CD54、CD55、CD59、 CD105、CD106和HLA-ABC
CD14、CD45、CD50、 CD56、HLA-DR和骨髓 基质细胞表面分子
肝实质细胞
在2006年4月第16卷4期的自然科学进展上，裴雪涛 等人发表的文章《人脂肪来源的干细胞体外培养特性及 分化为肝细胞样细胞的研究》。