海洋微生物

一、实验题目:从海洋微生物中提取产抗生素菌株

二、实验背景：海洋微生物包括海洋细菌、海洋真菌和海洋放线菌，其种类约为陆生微生物的20倍以上，海洋微生物其特殊的生存环境（高盐、高压、低温、低光照和寡营养），从而可合成一些结构新颖的抗生素，这是陆地微生物所不具备的。从海洋微生物中筛选新抗生素，实际上是由陆地资源发掘向整个自然界的延伸，开发海洋微生物资源的意义是重大的，表现在几个方面：

（1）海洋丰富的微生物资源为新药发现提供了多样的物种基础，它的开发将使人类进一步认识自然。

（2）新抗生素由于结构与作用机制可能有别于陆生来源的抗生素，将极大的克服目前的抗药性，同时为新药的合成提供新的“母核”。

（3）微生物易于培养、发酵，可无限再生而无需过度开发野生资源。

三、实验思路：

四、实验步骤：

五、实验原理

已知海洋微生物其特殊的生存环境（高盐、高压、低温、低光照和寡营养），从而可合成一些结构新颖的抗生素，抗生素可以抑制周围微生物的生长。若把这些微生物臵于含有供试菌的琼脂平板上，则其周围会形成一个圆形的不长菌的透明区域，即透明圈。这样就可以选择不同类型的微生物做供试菌，来寻找能抑制该类微生物生长的抗生素产生菌。本次实验采用的是纸片扩散法，其原理为：纸片中的药物向纸片周围扩散时形成递减的浓度梯度，纸片周围的实验菌生长若受到抑制，就会形成抑菌透明圈，透明圈越大、越透明，说明实验菌对该药物越敏感，反之，则不敏感。实验时，在固体培养基表面均匀涂布实验菌后，将滤纸片平整的贴在平板表面。取适量待测样品加到滤纸中央，培养一定时间后测量透明圈直径。该方法具有直观、快速的优点，在化合物分离纯化过程中还可以用来进行活性成分的追踪。

六、实验过程

（一）所用器皿的洗涤

1、刷洗、烘干：先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷蘸取去污粉刷洗，用自来水冲洗干净后再用蒸馏水洗2-3次，然后烘干。

2、泡酸、清洗：烘干后泡入酸液，24h后取出，立即用自来水冲洗，无色后用自来水冲洗12遍，后用三蒸水清洗三遍。

3、烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒、储存及防止灰尘再次污染。

4、高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的升高安全阀冒出蒸汽，当蒸汽成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指针随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）

5、烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸汽打湿，所以要放入烧箱内烘干备用。备注：金属器皿不能泡酸，洗涤时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲洗干净，然

后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或在空气中晾干。

放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。

橡胶和塑料：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，备用。

（二）所用培养基的配制

一、牛肉膏蛋白胨培养基的制备

实验目的：掌握培养基的配制原则与方法；

实验材料：器材：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅等。

试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等

实验原理：

培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素、能源和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基要选择合适的配比关系；选择合适的理化性质；配后要及时灭菌。

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。

实验内容：

1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备

（1）称量准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量，然后连同硫酸纸一起放入烧杯中。

（2）溶解向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍放冷。

（3）调pH值用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，

因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。

（4）分装根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内（如下图）。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌

污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高

度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。

（5）包扎试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。

（6）灭菌培养基用1.103mpa,121℃,高压蒸汽灭菌20min。

二、完全培养基（TYG培养基）

实验原理

完全培养基是用来培养和观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的合成培养基。配臵

时，除琼脂和葡萄糖外，混合配方中的其他成分，调节pH使比最终的pH略高0.2-0.4，加入琼脂，加热溶化后过滤，加葡萄糖溶液后摇匀，调节pH是灭菌后为7.0〒0.2,115℃，灭菌30min。

完全培养基配方如下：材料及器材

胰蛋白胨 10g 1、试剂

K2HPO4 3g 胰蛋白胨、K2HPO4、琼脂、酵母浸膏、

琼脂 15-20g 蒸馏水、葡萄糖。1mol/LNaOH、1mol/L

pH 7.0〒0.2 HCL。

酵母浸膏 5g 2、器材

葡萄糖 1g 试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、

蒸馏水 1000ml 培养基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳或橡皮筋、纱布等。

实验步骤

1、称量和溶化

参考实验原理

2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查。

备注：接种后，37℃,24h

再转移到牛肉膏蛋白胨培养基上培养37℃,24h

三、高氏I号培养基的制备