酶工程最终版

酶工程：酶的生产、改性和应用的技术过程。

产酶微生物具备特点：酶产量高、产酶稳定性好、易培养和管理、利于酶的分离纯化、安全无毒。

酶的分类：1.蛋白类酶：氧化还原、转移、水解、裂合、异构、合成（连接）；2.核酸类酶：分子内催化R、分子间催化R。

调节溶氧方法：调节通气量、氧的分压、气液接触时间、气液接触面积、改变培养液的性质。

动物细胞培养方式：悬浮培养、贴壁培养、微载体培养。

植物细胞培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养。

酶分子的修饰方法：（1）金属离子置换修饰（2）大分子结合修饰(共价/非共价)（3）侧链基团修饰（4）肽链有限水解修饰（5）氨基酸置换修饰（6）酶分子的物理修饰。

酶分子的修饰目的、作用：（1）提高酶的活力（2）增强酶的稳定性（3）降低或消除酶的抗原性【（4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响】

固定化酶的特点：（1）提高酶的催化效率（2）增加稳定性（3）可反复使用或连续使用（4）易于与产物分开。

酶改造的方法；物理方法改造：固定化：增加稳定性、提高活性、重复使用；化学方法改造：酶分子的修饰：增加稳定性、提高活性和降低抗原性；生物方法改造：定点突变和定向进化：增加稳定性、提高活性和增加适应性；人工方法模拟：模拟酶、抗体酶和杂合酶：人工方法实现酶的催化功能。抗体酶的制备：1.诱导法2.拷贝法

酶的催化特性：（1）专一性（2）高效性（3）温和性。

动物细胞培养方式：悬浮培养、贴壁培养、微载体培养。

植物细胞培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养。

酶反应器操作方式：分批式反应、连续式反应、流加分批式反应。反应器：反应罐、搅拌器、保温装置。

酶反应器的选择：（1）根据酶的应用形式选择反应器（2）根据酶反应动力学性质选择反应器（3）根据底物或产物的理化性质选择反应器（4）其他影响因素。酶反应器的类型（结构）（1）搅拌罐式反应器（游离酶催化、酶与底物结合、）（2）填充床式反应器（3）流化床反应器（酶与底物结合、）（4）鼓泡式反应器（气体参加）（5）膜反应器（高价酶、反馈抑制、小分子辅酶和分质量较大的底物和产物不采用）（6）喷射式反应器（高温淀

粉酶）。

蛋白酶可作为消炎剂，治疗各种炎症有很好的疗效。蛋白酶之所以有消炎作用，是由于它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症部位的坏死组织溶解，增加组织的通透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织积液的排出井抑制肉芽的形成。蛋白酶可治疗高血压：由于蛋白酶催化运动迟缓素原及胰血管舒张素原水解部分肽段而生成运动迟缓素和胰血管舒张素，使血压下降。

柚苷酶-除苦味；橙皮苷酶-防白色浑浊；花青素酶-脱色；果胶酶-果汁生产、果酒生产。酶是生物学有力的研究工具：基因工程工具酶，基因组学，蛋白组学。酶和工农业生产与医学实践有着密切的关系：1.工业用酶：淀粉糖业；2.农业用酶：饲料；3.医疗用酶：蛋白酶、检测试剂、抗病毒等新药物开发。酶在医药方面的应用：用酶进行疾病的诊断，用酶进行疾病的治疗，用酶制造各种药物。

酶在轻工、化工方面的应用：用酶进行原料处理、用酶生产各种轻工、化工产品，用酶增强产品使用效果；酶在环境保护中的应用：环境监测，废水处理，过氧化物酶，多酚氧化酶，可降解材料开发；酶在生物技术方面的应用：除去细胞壁，大分子切割，大分子连接。酶参与了生物体内所有的生命活动和生命过程：执行具体的生理功能-唾液、胃液中的消化酶，凝血酶等；清除有害物质,起保卫作用-过氧化物酶，朝氧化物岐化酶等；协同激素等生理活性物质在体内发挥信号转换,传递与放大作用,调节生理功能-蛋白激酶；催化代谢反应,建立各种各样代谢体系与代谢途径-葡萄糖、氨基酸、核酸代谢。

固定化植物细胞特点：（1）提高植物细胞的存活率和稳定性（2）细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团（3）利于生产各种所需次级代谢物（4）固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高生产率（5）固定化植物细胞易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。固定化动物细胞的特点：（1）提高细胞存活率（2）提高产率（3）固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间（4）固定化细胞易于与产物分开，利于产品纯化，提高产品质量。

酶催化的转换数（每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数）一般为1000/min左右。

条件温和原因：一是酶催化作用所需的活化能降低，二是由于酶是具有生物催化功能的生物大分子。在高温，高压，过高或过低PH等极端条件下，大多数酶会变性而失去其催化功能。

1.发酵中提高酶产量的措施：菌种选育：1.诱变育种：解除反馈阻遏—选育结构类似物

抗性突变株；解除分解代谢物阻遏—选育抗分解代谢阻遏突变株；2.基因工程育种：1）改变细胞调节基因，使菌种由诱导性变为组成型2）增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。条件控制：1.添加诱导物：包括酶的作用底物、反应产物和底物类似物，其中酶的底物类似物最有效，不能被酶作用或很少作用。2.降低阻遏物浓度：避免使用葡萄糖，采用较难利用的淀粉，避免培养基过于丰富，采用补料分批培养方式，分次流加碳源。3.添加表面活性剂：细胞内酶含量提高到一定程度，会被细胞内蛋白酶分解，加入表面活性剂可使胞内酶未被分解即被释放到胞外，因为表面活性剂有助于改善细胞通透性。4.添加产酶促进剂：酶促进剂对不同细胞、不通酶的作用效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度。如添加植酸钙镁可使桔青霉素生产磷酸二酯酶的量提高10－20倍。

2.酶定向进化的基本过程:随机突变、构建突变基因文库、定向选择。

酶定向进化的方法：首先通过从细胞内提取或者PCR等方法获得目标分子的基因，在体外采用易错PCR、DNA重排、基因家族重排等技术进行人工突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。定向进化的方法：1.无性进化方法：易错PCR法、盒式诱变；2.有性进化方法：DNA改组法、体外随机重组法、交错延伸法；3.其他：基因家族的同源重组、外显子的改组、杂合进化。

酶定向进化：是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。

易错PCR方法：向单一酶分子基因内随机引入突变(在PCR扩增过程中调整反应条件），制造突变酶库以便筛选；特点：遗传变化仅发生在单一分子内部，属于无性进化。改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降至5％-10％）,加入dITP来代替被减少的dNTP.缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+；提高镁离子浓度（常规PCR时浓度为0.5-2.5mmol/L）；添加一定浓度的锰离子。

DNA改组方法：从正突变基因库中分离得到的DNA序列用酶随机切割，得到的随机片断经不加引物的多次PCR循环，获得全长基因，实现优势突变的组合；特点：遗传变化仅发生在来自不同基因片断之间的重组，所以称为有性进化。实例：对内酰胺酶进行DNA改组，3次循环得到的进化酶对抗生物素头孢噻呜抗性增加32000倍；优点：将已有的正突变基因结合，正突变效率高；缺点：无引物PCR之前必须把DNase I去除干净，以防突变基因的被切割。