小鼠胚胎原位杂交ppt课件

杂交所需试剂的配置 探针的制备及纯化 杂交前胚胎的处理 杂交后胚胎的处理
显色及结果保存
杂交前探针长度和固定剂的选择
探针的长度一般应用于ISHH(原位杂交组织化学)探针的最佳长度应在50～10
个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。据报告，长500个 碱基的探针，其杂交时间约需20h左右。200～500个碱基的探针仍可应用，如
小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置
TBST: 1X TBS plus 0.1/1% Tween -20、2 mM (0.5 mg/ml)
Levamisole (左旋咪唑)
NTMT: 100 mM NaCl、 100 mM Tris-HCl, pH 9.5 50 mM MgCl2
0.1/1% Tween-20 2 mM (0.5 mg/ml) Levamisole 左旋咪唑 200X NBT: 50 mg/ml NBT in 70% DMF
双链DNA探针 单链DNA探针
PCsP6启动子 R
克隆至含有SP6和T7 启动子的载体中
质粒线性化
体外转录合成 RNA探针
试剂配置需要注意的事项
原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理,有 些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以 前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙
小鼠胚胎原位杂交
定义：
原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已 知碱 基,(比如转录所用的NTP的U碱基标记有DIG辛),顺序并带有标记物的核酸 探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配
对的原 则进行特异 性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系
超过500个碱基的探针则在杂交前最好用碱或水解酶进行水解，使其变成短的
片段，达到实验所需求的碱基数。 进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细 胞有固
定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：①能Leabharlann Baidu好地保持组织细胞的状
态；②对核酸无抽提、修饰及降解作用；③不改变被检核酸分子在 组织细胞内的定位； ④对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；⑤固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用， 如不使本底增加等；⑥理化性质稳定、价格低廉。 本实验选用4%的多聚甲醛。
统，通过 组织化学或免疫组织学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交
分类：
石蜡切片
信号。
切片原位杂交 整体原位杂交
冷冻切片
应用：
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测, 基因表达定位、核DNA和RNA的mRNA的排列和运输，复制和细胞的分类 (Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断
Hybridization solution: 50% formamide，5X SSC, pH 4.5 ，1% SDS
50 mg/ml yeast tRNA 50 mg/ml heparin
小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置
Solution I: 50% formamide 5X SSC, pH 4.5 ，1% SDS SolutionII:0.5M NaCl ,10mM Tris-HCl, 0.1%Tween-20 SolutionII加RNaseA .目的是消化未杂交上的ＲＮＡ. Solution III: 50% formamide 2X SSC, pH 4.5 Sheep serum: inactivate by heating to 70°C for 30 minutes, store in aliquots at -20°C. 10X TBS (for 1 liter): 80 g NaCl、 2 g KCl 、250 ml 1M Tris-HCl, pH7.5
200X BCIP: 25 mg/ml BCIP in water 要临时配制的试剂有：PBT, 用PBT配制的梯度甲醇，6%的过氧化氢，2毫克/
毫升的甘氨酸溶液，4% paraformaldehyde和0.2%
glutaraldehyde，TBST，封闭溶液（用TBST配制而 成的10%的热灭活的羊血清另加0.1%的封闭剂，抗
PBT: 1X PBS plus 0.1% or 1% Tween -20
NOTE: For mouse embryos, it is recommended that all solutions with Tween contain 1%, rather than 0.1%. Tween is routinely used at 0.1% in he chick protocol.
体的稀释（用2%的封闭剂/TBST稀释，每次漂洗约
1.7毫升），10%的封闭剂用 TBST配制。
探针的制备
一 探针的分类
DNA探针 cDNA探针 RNA探针(包括正义探针和反义探针） cRNA探针 寡合苷酸探针 二 探针的标记类型 放射性探针标记(如：同位素)，非放射性探针标记(生物素，荧光标记，地高辛标记) 三 RNA探针的得到：
(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定
(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。
进行整体原位杂交的优点：
整体原位杂交具有易操作、周期短、整体效果明显等特点，是一种较新的 组织原位杂交方法。胚胎是个体发育的最初阶段，整体原位杂交作为检测 胚胎发育过程中基因表达整体效果的快速、有效手段，已在果蝇，小鼠， 线虫，斑马鱼，鸡等少数几种动物中应用。
因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,不会 影响探针穿透入细胞或组织.
探针长度３００－１０００bp比较好的选择.
小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置
10X PBS(1 liter): 80 g NaCl 、2 g KCl 、14.4 g Na2PO4 、2.4 g KH2PO4
(adjust to pH 7.4 with HCl and bring to 1 liter with water)