遗传工程和转基因技术0801
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编码热敏感lac阻遏物的温度敏感突变体lacI基因，为诱导 1ac及其派生启动子提供了方便的手段。
1. 在启动子tac的一10和一35元件之间有一段17bp的间 隔序列。
2. 核糖体结合位点,RBS 由Shine—Dalgarno,SD序列及 其后的一段富含AT碱基的转译间隔区组成，间隔区的最 适长度约为8个碱基。
量占细胞总蛋白的10％～30％以上。 2. 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平。
3. 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的 诱导物而得以诱导。
如在大批量的蛋白质制备中，热和化学诱导便是两种广泛使 用的方式。
IPTG是杂种强启动子tac和trc的一种有效的化学诱导物。 但对于人类临床药用蛋白质的大批量制备，IPTG则不是理想 的诱导物，因为它有毒性。
• T7启动子 来自于T7噬菌体，有该启动子并在T7 RNA聚合酶驱动下表 达外源基因的大肠杆菌质粒称为pET表达载体家族。 T7噬菌体RNA聚合酶不仅能够选择性的与T7启动子结合， 而且在不降低启动效率的前题下，其沿DNA模板合成 mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5 倍，因此提高了 对外源基因的转录水平。
3. 在转译起始期间，SD序列与16srRNA的3末端发生作 用。
4. 三个起始密码子及其在大肠杆菌中的使用频率。三个终 止密码子中其后连着U的UAA是大肠杆菌最有效的转译 终止密码子。
1. 调节基因R 编码阻遏物，可调节启动子的 活性，它既可以存在于表达载体上，也可以 是整合在寄主染色体上。
2. 转录终止子，TT 可使mRNA和载体分子 稳定。抗菌素抗性基因，ter为载体提供了 表型选择记号，复制起点，0ri决定着载体 的拷贝数。
pcDNA3.1/His表达载体
pCDNA3.1/His表达载体是Invitrogen公司的产品，载体采用人 巨细胞病毒的立即早期启动子，用来在哺乳动物细胞内获得高表达 的外源基因及进行基因功能的研究。
pCDNA3.1/His载体是一种穿梭质粒表达载体，带有pUC质粒的 复制起点和ampr基因，可以在大肠杆菌内扩增和选择重组转化子， 同时载有SV40的复制起点和新霉素抗性基因，可以在表达SV40T 抗原的细胞内复制并选择重组转化子。
pET表达系统表达外原蛋白必须使用特殊的大肠杆菌受体菌， 如BL21和HNS174。
这些菌株是λ噬菌体的溶源衍生菌，其染色体上含有PlacUV5 启动子控制下的T7 RNA聚合酶基因。
pET表达系统是一个基因表达的级联反应，IPTG首先诱导 PlacUV5启动子表达T7 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶再选择 性的结合T7启动子启动外源基因的转录。
组织纤溶酶原激活物克隆表达
• tPA 纤溶酶原 → 纤溶酶 → 水解纤维蛋白 （可用于血凝 块的溶解，治疗血栓梗塞性疾病）
• tPA基因（信号肽 和tPA CDNA） 表达载体 → 重组载体 → 转染哺乳动物细胞 →用HAT培养基选择出稳定的转染细胞 → 细胞表达低水平的tPA → Mtx（氨甲蝶呤）筛选 →细 胞表达高水平的tPA → 细胞在发酵器培养 → tPA分泌tPA 于培养液中。
• tac启动子 是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，但仍可以用IPTG诱导， tac是一个非常强的启动子，由tac启动子启动的基因的转录水平比lac和 trp启动子高。
• PL启动子 来自λ噬菌体，也是一个非常强的启动子。 受λ噬菌体阻遏 基因cI编码的阻遏蛋白的控制，表达载体的宿主菌带有一 个cI基因温度敏感突变体，它表达的阻遏蛋白在28～30℃ 才有活性，能够阻抑启动子的表达；当温度提高到42℃时， 它的表达产物失去活性，启动子能够转录外源基因。这种 温度诱导的特性是以PL为表达载体的一大优点。
克隆载体
克隆质粒载体 基因克隆的目的不仅是为了获得大量的克隆在载体上的
DNA 片段，而且还要考虑后续实验如测序，表达，突变的要求。
pGEM-T和pGEM-T Easy载体wk.baidu.com
1. PCR扩增中常用的DNA聚合酶Taq DNA聚合酶可以不需要 模板在PCR产物上加一个A，一些生物公司根据这一特点研 究制了T载体。
表达质粒载体
1. 原核表达质粒载通常须具有一个强的启动子，一个位于 启动子和起始密码子ATG之间的核糖体结合序列以及位 于外源基因插入序列下游的转录终止序列。
2. 原核表达载体常用的启动子
• lac启动子 较早使用的启动子，来自大肠杆菌的乳糖操纵子，常用IPTG诱导，启动外 源基因的表达。
• trp启动子 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，表达载体上的启动子常常包含操纵子的启 动基因，操纵基因和部分trpE基因，删除了衰减子序列，在β-吲哚丙氨 酸的诱导下，转录水平比大肠杆菌中的正常启动子提高8到10倍。
哺乳动物细胞
生产哺乳动物蛋白质的最佳表达系统。 启动子，载体，转染方法 在哺乳动物细胞稳定组入扩增基因，可供产生大量蛋白 缺点 细胞培养价格高于细菌和酵母和昆虫细胞。
启动子
可使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备后面这 几个条件 1. 它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达
DNA限制性内切酶消化
2. 在pGEM-T载体的两边还分别有一个限制性内切酶BstZ I的 识别位点，如果在外源DNA片段上没有该酶的识别位点， 只用该酶就可以将外源基因完整的切下来，根据酶切片段的 大小对重组质粒进行签定。在pGEM-T Easy质粒的插入点 两边，增加了EcoR I和Not I酶切位点，使外源DNA片段的 鉴定更加容易。
表达载体起始密码子下游有一段编码6个组氨酸的DNA片段及编码 一段短肽DLYDDDDK的DNA片段，外源基因克隆在这些基因的 上游，构成融合基因。
此融合基因能够表达目的蛋白和组氨酸，故通过标记组氨酸可分离 纯化目的融合蛋白，组氨酸可以作为检测融合蛋白的标签。
在表达载体上设计有蛋白酶的识别和切割位点，用蛋白酶可以切除 融合蛋白上非目的蛋白的氨基因酸序列如组氨酸和DLYDDDDK短 肽。
1. 在启动子tac的一10和一35元件之间有一段17bp的间 隔序列。
2. 核糖体结合位点,RBS 由Shine—Dalgarno,SD序列及 其后的一段富含AT碱基的转译间隔区组成，间隔区的最 适长度约为8个碱基。
量占细胞总蛋白的10％～30％以上。 2. 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平。
3. 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的 诱导物而得以诱导。
如在大批量的蛋白质制备中，热和化学诱导便是两种广泛使 用的方式。
IPTG是杂种强启动子tac和trc的一种有效的化学诱导物。 但对于人类临床药用蛋白质的大批量制备，IPTG则不是理想 的诱导物，因为它有毒性。
• T7启动子 来自于T7噬菌体，有该启动子并在T7 RNA聚合酶驱动下表 达外源基因的大肠杆菌质粒称为pET表达载体家族。 T7噬菌体RNA聚合酶不仅能够选择性的与T7启动子结合， 而且在不降低启动效率的前题下，其沿DNA模板合成 mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5 倍，因此提高了 对外源基因的转录水平。
3. 在转译起始期间，SD序列与16srRNA的3末端发生作 用。
4. 三个起始密码子及其在大肠杆菌中的使用频率。三个终 止密码子中其后连着U的UAA是大肠杆菌最有效的转译 终止密码子。
1. 调节基因R 编码阻遏物，可调节启动子的 活性，它既可以存在于表达载体上，也可以 是整合在寄主染色体上。
2. 转录终止子，TT 可使mRNA和载体分子 稳定。抗菌素抗性基因，ter为载体提供了 表型选择记号，复制起点，0ri决定着载体 的拷贝数。
pcDNA3.1/His表达载体
pCDNA3.1/His表达载体是Invitrogen公司的产品，载体采用人 巨细胞病毒的立即早期启动子，用来在哺乳动物细胞内获得高表达 的外源基因及进行基因功能的研究。
pCDNA3.1/His载体是一种穿梭质粒表达载体，带有pUC质粒的 复制起点和ampr基因，可以在大肠杆菌内扩增和选择重组转化子， 同时载有SV40的复制起点和新霉素抗性基因，可以在表达SV40T 抗原的细胞内复制并选择重组转化子。
pET表达系统表达外原蛋白必须使用特殊的大肠杆菌受体菌， 如BL21和HNS174。
这些菌株是λ噬菌体的溶源衍生菌，其染色体上含有PlacUV5 启动子控制下的T7 RNA聚合酶基因。
pET表达系统是一个基因表达的级联反应，IPTG首先诱导 PlacUV5启动子表达T7 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶再选择 性的结合T7启动子启动外源基因的转录。
组织纤溶酶原激活物克隆表达
• tPA 纤溶酶原 → 纤溶酶 → 水解纤维蛋白 （可用于血凝 块的溶解，治疗血栓梗塞性疾病）
• tPA基因（信号肽 和tPA CDNA） 表达载体 → 重组载体 → 转染哺乳动物细胞 →用HAT培养基选择出稳定的转染细胞 → 细胞表达低水平的tPA → Mtx（氨甲蝶呤）筛选 →细 胞表达高水平的tPA → 细胞在发酵器培养 → tPA分泌tPA 于培养液中。
• tac启动子 是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，但仍可以用IPTG诱导， tac是一个非常强的启动子，由tac启动子启动的基因的转录水平比lac和 trp启动子高。
• PL启动子 来自λ噬菌体，也是一个非常强的启动子。 受λ噬菌体阻遏 基因cI编码的阻遏蛋白的控制，表达载体的宿主菌带有一 个cI基因温度敏感突变体，它表达的阻遏蛋白在28～30℃ 才有活性，能够阻抑启动子的表达；当温度提高到42℃时， 它的表达产物失去活性，启动子能够转录外源基因。这种 温度诱导的特性是以PL为表达载体的一大优点。
克隆载体
克隆质粒载体 基因克隆的目的不仅是为了获得大量的克隆在载体上的
DNA 片段，而且还要考虑后续实验如测序，表达，突变的要求。
pGEM-T和pGEM-T Easy载体wk.baidu.com
1. PCR扩增中常用的DNA聚合酶Taq DNA聚合酶可以不需要 模板在PCR产物上加一个A，一些生物公司根据这一特点研 究制了T载体。
表达质粒载体
1. 原核表达质粒载通常须具有一个强的启动子，一个位于 启动子和起始密码子ATG之间的核糖体结合序列以及位 于外源基因插入序列下游的转录终止序列。
2. 原核表达载体常用的启动子
• lac启动子 较早使用的启动子，来自大肠杆菌的乳糖操纵子，常用IPTG诱导，启动外 源基因的表达。
• trp启动子 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，表达载体上的启动子常常包含操纵子的启 动基因，操纵基因和部分trpE基因，删除了衰减子序列，在β-吲哚丙氨 酸的诱导下，转录水平比大肠杆菌中的正常启动子提高8到10倍。
哺乳动物细胞
生产哺乳动物蛋白质的最佳表达系统。 启动子，载体，转染方法 在哺乳动物细胞稳定组入扩增基因，可供产生大量蛋白 缺点 细胞培养价格高于细菌和酵母和昆虫细胞。
启动子
可使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备后面这 几个条件 1. 它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达
DNA限制性内切酶消化
2. 在pGEM-T载体的两边还分别有一个限制性内切酶BstZ I的 识别位点，如果在外源DNA片段上没有该酶的识别位点， 只用该酶就可以将外源基因完整的切下来，根据酶切片段的 大小对重组质粒进行签定。在pGEM-T Easy质粒的插入点 两边，增加了EcoR I和Not I酶切位点，使外源DNA片段的 鉴定更加容易。
表达载体起始密码子下游有一段编码6个组氨酸的DNA片段及编码 一段短肽DLYDDDDK的DNA片段，外源基因克隆在这些基因的 上游，构成融合基因。
此融合基因能够表达目的蛋白和组氨酸，故通过标记组氨酸可分离 纯化目的融合蛋白，组氨酸可以作为检测融合蛋白的标签。
在表达载体上设计有蛋白酶的识别和切割位点，用蛋白酶可以切除 融合蛋白上非目的蛋白的氨基因酸序列如组氨酸和DLYDDDDK短 肽。